TRzol LS（液體樣本 RNA 提取試劑）公司正在出售的產品：新生隱球菌基因組DNAA431(A-431)人表皮癌細胞6磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）測試盒（比色法）牙齦卟啉單胞菌基因組DNAA498人腎癌細胞肌酸激酶(CK)測試盒（比色法）熒光假單胞菌基因組DNAA549 人肺癌細胞 硫氧還蛋白氧化還原酶（TrxR）測試盒（比色法）詹氏乳酸桿菌基因組DNAA549+RF

商品屬性：

儲存條件：

TRzol LS 在室溫下能穩定保存 12 個月。盡管如此，為達到最佳效果，我們建議保存在 2-8°C 的環境下。

重要提示：

有毒物接觸皮膚或者不慎吞服，會導致灼傷。一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗。若感不適，看醫生并尋求和其他成分的正確治療方案。

產品介紹：

TRzol LS試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層、中間層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來回收。無論是人、動物、植物還是細菌，該方法對少量及大量的組織和細胞均有較好的分離效果。TRzol LS 試劑操作上的簡單性允許同

時處理多個樣品。所有的操作可以在一小時內完成。TRzol 抽提的總 RNA 能夠避免DNA 和蛋白的污染，可用于 RNA 印跡分析、斑點雜交、poly(A)+篩選、體外翻譯、RNA 酶保護分析和分子克隆。如果是用于 PCR，當兩條引物位于單一外顯子內時，建議用擴增級的DNase I 來處理抽提的總RNA。

注意事項：

1.從少量的組織(1~10mg)或細胞(10 2-10 4 個)中分離RNA 樣品：往組織或細胞中加 入 800µl TRzol。待樣品裂解后，加入氯仿并進行步驟 2 中的抽提操作。在用異丙醇沉 淀 RNA 之前，加入 5~10μg 無 RNA 酶的glycogen 作為水樣層的載體。為降低其黏度 在加入氯仿前用 26 號注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。Glycogen 會留在水樣層中 并和 RNA 共析出。在濃縮到 4mg/ml 之前它不會抑制逆轉錄反應第一鏈的合成也不會 抑制 PCR。

2.在勻漿化后和加入氯仿之前，樣品可以在-60℃或者-70℃保存至少一個月。將 RNA 沉淀溶于 75%的乙醇在 2-8℃至少可以保存一周，在-5—-20℃下至少可保存一年。

3.用 TRzol LS 抽提 RNA 時要戴手套和護眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學通 風櫥完成操作。避免呼吸道吸入。如無例外，室溫保持在 15~30℃的條件下。

自備試劑：

氯仿 、 異丙醇、75%乙醇(RNase-Free water 配制)、RNase-Free water（將水加入 無 RNA 酶的玻璃瓶中，加入 DEPC 至 0.1% (V/V)。放置過夜并高壓滅菌）。0.5% SDS 溶液(RNase-Free water 配制)（可選）。

操作步驟：

1.樣品預處理 a.生物液體 每0.25ml液體樣品(血清，血漿等等)加入0.75ml TRzol LS，用加樣槍吹打液體樣品 幾次以幫助裂解樣品中細胞。每5~10×10 6個細胞至少加入0.75ml TRzol LS。對于含有高 污染物樣品如全血樣品，可以用滅菌水按照1：1比例稀釋一倍后開始提取。TRzol LS 和液體樣品的終體積比總是3：1。 b.組織 用glass或強力勻漿器攪勻組織樣品，每50~100mg組織或者0.25ml組織懸液加 0.75ml的TRzol LS。一般50~100mg組織體積都要小于0.25ml，如果組織樣品的體積小 于0.25ml，加入滅菌水將組織樣品體積調整到0.25ml以保證體積比例是3：1。 c.單層生長的細胞 直接往直徑3.5 cm的培養板中加入0.3ml-0.4ml的TRzol LS溶解細胞，用加樣槍吹打 幫助充分裂解細胞。依據培養板的面積而不是依據細胞的數量來決定所需的TRzol LS 量 （每10cm2加0.3-0.4ml）。不需要往裂解物里面加水，因為培養板中附著殘留的培養液 已經充分稀釋了TRzol LS 。 d.懸浮生長的細胞 通過離心來沉淀細胞。在TRzol LS試劑中用移液管反復吹打來裂解細胞。每 5~10×10 6的動物細胞，植物或酵母菌細胞或每1×10 7細菌加0.75ml的TRzol LS。和步驟 b 一樣用滅菌水調節樣品體積到0.25ml。在加入TRzol LS前應避免洗滌細胞，因為那 樣會增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和細菌可能需要使用勻漿器。 2.分離階段 將勻漿樣品在15-30°C條件下孵育5min以使核蛋白體分解。每0.75ml TRzol LS 加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并將其在室溫下孵育2~15 min。 在2~8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心15 min。離心后混合物分成三層： 下層-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在于水樣層當中。 水樣層的容量大約為所加TRzol LS 容量的70%。

2.RNA 的沉淀 將水樣層轉移到一干凈的試管中，如果希望分離DNA和蛋白，有機層和中間層同 樣要予以保留。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。每0.75ml TRzol LS對應0.5ml 異丙醇。將混合的樣品在15-30°C條件下孵育10min并在2~8°C下以不超過12,000×g的離 心力高速冷凍離心10 min。RNA沉淀在離心前通常不可見，離心后會形成一膠狀片狀 沉淀附著于試管壁和管底。

3.RNA 的漂洗 移去上層懸液。用75%的乙醇(RNase-Free water配制)洗滌RNA沉淀一次，每0.75ml 的TRzol LS至少加1ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2~8°C下以不超過7,500×g的 離心力高速冷凍離心5 min。

4.RNA 的再溶解 室溫簡單干燥 RNA 沉淀，不要在真空管里離心干燥 RNA。尤為重要的是，不能讓 RNA 沉淀干燥那樣會極大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 樣品其 OD260 /OD280 比值<1.6 。用移液管分幾次移取 RNase-Free water 或 0.5%SDS 溶液 (RNase-Free water 配制)來溶解RNA（如果RNA 以后要用于酶切反應時，避免使用SDS。） RNA 還能被 100%甲酰胺（除去離子）再溶解并保存在-70°C。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子，進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止濃度過大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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