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上海精瑞科學(xué)儀器有限公司

AAV完整和空殼分離新辦法

時(shí)間:2020-6-15閱讀:1309
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現(xiàn)狀
基于腺相關(guān)病毒(AAV)的各種血清型載體被*在人類基因治療和基因疫苗接種應(yīng)用中具有高潛力。在制造AAV載體期間,不必要的,不*的顆粒共同產(chǎn)生。它們?nèi)狈χ亟M病毒基因組,僅由空衣殼蛋白組成。空衣殼增加了用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用的AAV病毒的所需劑量,并且被認(rèn)為引起針對(duì)載體衣殼的免疫反應(yīng),導(dǎo)致不必要的副作用。因此,在制造過(guò)程中去除空衣殼以及量化制劑中空AAV顆粒含量的能力是任何AAV生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵要求。
                                                                      
? 制備AAV載體的常規(guī)方法
  目前用于制備分離空衣殼(CsCl或碘克沙醇梯度)的方法對(duì)于放大是具有挑戰(zhàn)性的并且不適合于大規(guī)模生產(chǎn)。此外,用于檢測(cè)空衣殼的分析方法和全空粒子比的測(cè)定(電子顯微鏡(EM)測(cè)定,總粒子測(cè)定[ELISA]結(jié)合基因組拷貝滴定[qPCR])耗費(fèi)時(shí)間和勞動(dòng)力,受操作者的影響技術(shù)或不提供用于不同血清型AAV的容易獲得的試劑。
                                                                                    
?新突破
本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了利用微小電荷差異分離全空和空AAV8顆粒的新方法。通過(guò)在BIA Seperations 的CIMmultus™ QA Monolithic column整體柱上使用線性梯度洗脫,引入了用于分析AAV顆粒的簡(jiǎn)單,快速和可重復(fù)的分析。該方法成功應(yīng)用于通過(guò)兩種不同制造工藝制備的AAV8顆粒。

 材料與方法
通過(guò)CsCl梯度離心制備純化的完整和空AAV8載體顆粒的病毒制劑。
通過(guò)切向流過(guò)濾(TFF)然后通過(guò)碘克沙醇梯度進(jìn)行AAV8的替代制備。

結(jié)果
電子顯微鏡
通過(guò)電子顯微鏡分析AAV8制劑制劑中*和空顆粒的存在。 空殼用箭頭表示(圖1)。


全衣殼和空殼AAV顆粒的色譜分離
  用完整和空AAV8載體顆粒的CsCl梯度制備物進(jìn)行初始結(jié)合 - 洗脫實(shí)驗(yàn)。 線性鹽梯度下的不同保留體積表明可以對(duì)全載體和空載體顆粒進(jìn)行色譜分離(數(shù)據(jù)未顯示)。
  基于這些結(jié)果,將全粒子和空粒子的混合物應(yīng)用于CIMmultus™ QA Monolithic column整體柱(圖2)。 將任意體積的75μL空衣殼制劑與1×10 12 GC的含有93.7%完整AAV載體顆粒(通過(guò)EM測(cè)量)的制劑混合(圖2)。
 
  檢測(cè)到代表空衣殼和完整衣殼的明顯可區(qū)分的峰。 后來(lái)的洗脫峰含有> 99%的負(fù)載的全顆粒(通過(guò)qPCR測(cè)定)。 空衣殼的計(jì)算相對(duì)量(根據(jù)測(cè)量的峰面積)為34%(圖2)。
  然后使用AAV8衣殼的色譜分離來(lái)分析不同AAV制劑中的全粒子與空粒子比率。 基于色譜峰積分,通過(guò)CsCl梯度(通過(guò)EM測(cè)量的93.7%飽和度)對(duì)AAV制劑的定量導(dǎo)致空 - 滿比率為0.016(1.6%空顆粒),而0.067(空顆粒為6.28%) 由EM分析確定(數(shù)據(jù)未顯示)。

通過(guò)替代方法產(chǎn)生的AAV顆粒的色譜分離和定量
  接下來(lái)評(píng)估基于CIM QA的分離和定量的適用性,用于替代的AAV制備(通過(guò)TFF制備,隨后是碘克沙醇梯度)。 將含有相當(dāng)于5×10 12 GC的AAV制劑加載到CIMmultus™ QA Monolithic column上,并用線性梯度洗脫分離,如色譜圖所示(圖3)。 與由CsCl制備的AAV相比,加載的AAV顆粒多5倍(圖2),這導(dǎo)致洗脫峰變寬。 在20.0分鐘洗脫的次要峰的峰面積與在22.2分鐘洗脫的主峰的積分(圖3)表明空 - 滿比為0.026(2.5%空顆粒),與EM獲得的比例很好地一致( 空 - 滿比率為0.05;空顆粒為4.5%)。

為了證明該方法對(duì)不同AAV生產(chǎn)過(guò)程的適用性,AAV樣品摻入空顆粒制劑,使用相同的梯度條件注入CIMmultus™ QA Monolithic column(圖4)。
分離和定量AAV顆粒(TFF和碘克沙醇梯度),加入空衣殼AAV

?結(jié)論:
 開(kāi)發(fā)了一種快速,可重復(fù)的方法,用于在CIMmultus™ QA Monolithic column上通過(guò)線性梯度洗脫分離和定量空顆粒和全顆粒AAV8載體。 該方案成功地用于兩種不同的AAV制劑,并且能夠定量空衣殼含量,這與替代方法一致。 色譜方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單,快速,不依賴于操作員技術(shù)和需要專門(mén)的試劑。 相反,它在單次測(cè)定中提供粒子特征的定量分析,運(yùn)行時(shí)間為30分鐘。

上海精瑞科學(xué)儀器有限公司

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