兩步質粒DNA純化分離rRNA~加速神器 CIM DEAE整體柱

兩步質粒DNA純化分離rRNA~加速神器 CIM DEAE整體柱

  面對如此眾多品種的質粒，有沒有一種質粒 DNA 純化平臺，能夠適用多種質粒的、可放大的，滿足基因治療、細胞治療和疫苗的高純度和同質性的標準要求，并且還需要有效，穩健和可擴展的下游過程呢?

   接下來為大家隆重介紹 BIA Separations 提供的，基于對流相互作用介質（CIM）層析整體柱的兩步質粒 DNA（pDNA）純化平臺！
   該方法除了具有以上全部優點，并且可以明顯降低純化時間，提高生產效率，使其成為 GMP 環境下的大規模 pDNA 純化的選擇。
   該方法專為純化大分子和納米顆粒的整體柱而設計，可實現快速操作，高流量，同時提供動態結合能力和分辨率。

首先要為整個過程中的核心——兩步層析步驟，準備細菌培養液
 

1. 大腸桿菌收獲、裂解－堿裂解：
 

這是快速高效純化質粒 DNA 亞型的基礎。
 

操作建議：
 

  先收集菌體；
  然后采用堿性裂解法制備原料；

  再將細菌細胞（通常是細胞生物質或細胞沉淀）懸浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；

  通過加入等體積的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 進行裂解。

2. 裂解液濃縮：
 

氯化鈣沉淀后澄清，除去了大量的主要樣品雜質

???????   裂解后，懸浮液變粘稠，通過加入與懸浮緩沖液等體積的，4-8℃ 冷卻的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀細胞碎片和 SDS 復合物。

???????   在溫和混合下，緩慢加入 CaCl2 并孵育 15 分鐘。

TIPS:
 

1. 氯化鈣用作沉淀劑，以去除 RNA、基因組 DNA 和其他雜質;

2. 較高濃度的雜質需要 CaCl2 濃度高達 1M;

3. 考慮測試多種濃度并評估產品中雜質的有效去除和未受影響的 pDNA 產量;

4. 加入速度應該很慢，以防止局部溫度上升;

5. 孵育后，進行一系列澄清步驟，從離心或粗過濾開始，例如 80μm 深度過濾，并以 1-5μm 過濾結束。

（低溫有利于沉淀，混合過程應該溫和操作，以防止 DNA 降解。）

前面 blabla 說了那么多，然而純化才是本工藝的精華所在。
 

BIA Separations 的二步純化工藝的穩健性、連貫性、時效性，均堪稱教科書式的經典。
 

一步純化的柱子，通過弱陰離子交換，濃縮 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA；
 

第二步利用疏水相互作用色譜（HIC）的拋光步驟，進一步從超螺旋（SC）治療級 pDNA 中除去開環（OC）和線性 pDNA 亞型。
 

兩步純化的作用功能明確、互相合作，大大節省操作步驟和時間。

???????   AEX 色譜柱（CIMmultus™DEAE）濃縮 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA。

???????   在弱陰離子交換柱上捕獲質粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白質，樣品結合需要低電導率，通過稀釋實現。 

???????   隨著增加 NaCl 的梯度洗脫，首先洗脫 RNA，然后洗脫質粒 DNA。

層析條件
 

*1 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。
 

層析方法
 

1.  用去離子水稀釋細菌裂解物至電導率為 35-40mS / cm。稀釋取決于樣品制備過程中添加的 CaCl2 濃度。

2.  將稀釋的樣品用 0.45μm 過濾器進行過濾。

3.  將 20CV 的緩沖液 A1 平衡 DEAE 柱。

4.  將澄清的稀釋細菌裂解液進行上樣。

5.  用 20 CV 的緩沖液 A1 對色譜柱進行流洗。

6.  用 20 CV 的緩沖液 A2 對色譜柱進行流洗。

7.  用 20 CV 的緩沖液 A3（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

圖 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的質粒 DNA 洗脫曲線

???????    在高配體密度丁基修飾的（CIMmultus TM C4 HLD）整體柱上，利用疏水相互作用色譜柱（HIC）的拋光步驟，進一步從        超螺旋（SC）治療級 pDNA 中除去開環（OC）和線性 pDNA 亞型。

??????? ???????   為了富集質粒 DNA 的超螺旋亞型，將 DEAE 洗脫液上樣到高配體密度丁基柱（C4 HLD）上。 

??????? ???????   該步驟進一步去除了雜質。

層析條件

*2 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。
 

層析方法

1.  調節來自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脫液，每 1 體積（V）洗脫液加入 3 體積（V）的 4M(NH4)2SO4。

2.  用 20CV 的緩沖液 B0 來平衡 C4 HLD 柱。

3.  將 DEAE 柱洗脫的 pDNA 組份上樣。

4.  用 20 CV 的緩沖液 B1 流洗色譜柱。

5.  用緩沖液 B2（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。

6.  用 30 CV 的緩沖液 A1 再生色譜柱。

7.  加樣 3 次后，對柱子進行清洗。

圖 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分離超螺旋質粒 DNA

·  從 C4 HLD 柱洗脫的超螺旋 pDNA 組份含有硫酸銨，必須在生物應用質粒之前將其除去。

·  緩沖液交換可通過透析濾過或體積排除色譜等方法進行。

·  配置和填充可能需要額外的處理。
 

二步法層析過程分析：

???????    質粒 DNA 制造成功的關鍵是實時過程控制方法，確保終產品中高百分比的超螺旋 pDNA。 

??????????   CIMac™pDNA 分析柱可用于監測降解產物（開環和線性 pDNA），去除雜質（RNA），并確保每個生產步驟都能產生預期的超螺旋 pDNA 量。

???????   ???????CIMac™pDNA 分析柱還用于超螺旋質粒 DNA 含量的質量控制。

圖 3：使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的質粒 DNA 亞型含量的質量控制

結果和結論：
 

??????? ?????  通過優化裂解、沉淀和兩種色譜步驟相結合，可生產滿足所有監管要求的純 pDNA。

??????? ???????  可以完成去除 99% 以上的主要雜質（RNA，基因組 DNA，宿主細胞蛋白，內毒素和開環 pDNA）。

??????? ???????  此外，快速（大腸桿菌的 pDNA 提取和純化可在幾小時內完成），可重復的過程可降低運營成本并提高工廠生產率。 

??????? ???????  *的整體特性有助于該過程的直接可擴展性，涵蓋從小規模實驗室到大規模工業純化 pDNA 的生產水平。

Table 1: Process results.

點評 
 

目前市面上有不少質粒純化工藝方案，但是比較下來，BIA 二步法純化工藝具有兩大優勢：
 

???????  效率明顯提高

只需兩步色譜和高流速的整體柱色譜方案，減少工藝步驟（提高回收率）并加快純化速度，從而顯著提高生產率。
 

???????   靈活放大

由于特定的整體柱設計，質粒 DNA 過程可以快速擴展到更大的單位。 

在 1 毫升色譜柱上設計的工藝可以輕松轉移到試驗和生產規模。

在 8L 色譜柱上單次運行可以產生 48 g 藥物級 scDNA。
 

Table 2: Scale up options.

十多年來，BIA Separations 一直是高效率質粒純化的好選擇。它不僅提供整體柱和平臺模板，還提供定制的純化服務，以*您的質粒 DNA 純化需求。