緊湊型細胞沉降器

我們現在已經開發出這種成熟技術的更緊湊、更高效的放大版本，并為其中四種新穎的設計申請了專li。

使用這些更高效、更緊湊的設計，經過驗證的強大傾斜沉降器技術現在也可以適用于從重組微生物酵母細胞中生產治療性蛋白質。

這張照片顯示了一個實驗室/中試規模的細胞保留裝置（左側）連接到一個 5 升生物反應器，在高細胞密度灌注操作中連續培養酵母畢赤酵母細胞數周。

所示的較小裝置（右側）預計可從 5 升哺乳動物細胞灌注生物反應器培養物中產生約 5 vvd 澄清的收獲流，其中僅包含死細胞和細胞碎片以及分泌產物。

我們正在申請專li的內部沉降表面使其成為一個強大和緊湊的細胞分離裝置，通過收獲流選擇性地去除死細胞和細胞碎片，并將活細胞和生產細胞完回收回灌注生物反應器。

使用新型 Compact Cell Settler 原型對酵母細胞進行灌注生物反應器培養

我們在新設計的新型緊湊型細胞沉降器中大大增加了傾斜沉降器表面，其占地面積與 CS-10 相同。

因此，我們能夠以超過 5 升/天的更高灌注流速從生長酵母畢赤酵母細胞的 5 升灌注生物反應器中獲得澄清的收獲，超過哺乳動物細胞培養物中每天 1 體積交換的典型灌注率。

如圖所示，生物反應器 OD600 保持在 700 以上超過 2 個月。生物反應器 OD 從 200 小時到 1000 小時的小波動是由于我們對灌注速率和進料甘油濃度的操作。

沉降器頂部流出物或收獲物澄清，其 OD600 大多在 10 和 30 之間，代表生物反應器中酵母細胞的不到 5%。

基于更大尺寸的 CHO 細胞，預計這種相同尺寸的沉降器（直徑 12 英寸，如上一頁底部照片所示）每天能夠從哺乳動物細胞中獲得超過 250 升的澄清收獲物。

與重復補料分批培養相比，從灌注生物反應器中收獲的產品更高

在開始灌注之前的初始補料分批操作期間，分泌的蛋白質產物在生物反應器中積累至 >1.5 g/L 的滴度。灌注開始后，生物反應器中的蛋白質滴度由于

連續收獲到流出物中并被新鮮培養基稀釋而降低。

從 200 小時到 1000 小時，蛋白質滴度保持相對恒定，而灌注率大約為 2 升/天左右。隨著灌注率在灌注生物反應器運行的兩個月內逐漸增加，特別是在 1000 小時后，

由于收獲和稀釋率增加，蛋白質滴度略有下降。

然而，與較低灌注率下的早期值相比，收獲罐中蛋白質積累的速率（灌注率和蛋白質滴度的產物）在較高灌注率下增加得更快。在兩個月長的灌注操作中，

從這個以逐漸增加的灌注速率操作的 5 升生物反應器中積累的蛋白質收獲量為 160 g。

這個數量比在相同的兩個月期間從相同的 5 升生物反應器中進行大約 8 次重復補料分批培養操作的澄清上清液中收獲的數量高出 4 倍以上。

Compact Cell Settlers 更適用于哺乳動物細胞的高細胞密度灌注生物反應器培養

不銹鋼緊湊型細胞沉降器可用于在哺乳動物（例如 CHO）細胞的連續灌注培養中實現高細胞密度和高活力。在這張照片中，我們展示了一個典型的 6

英寸直徑緊湊型沉降器與連續灌注生物反應器的連接，該反應器用于培養 CHO 細胞超過兩周。由于哺乳動物細胞大于 10 微米，并且比酵母細胞大，因此我們需要比酵母細胞更小的緊湊型定居器。

來自生物反應器的細胞培養液通過蠕動泵通過水平端口（隱藏在前景中帶有 Sudhin Biopharma Co. 徽標的不銹鋼沉降器后面）泵入沉降器中。沉降的 CHO

細胞通過蠕動泵從底部端口返回到生物反應器中。沉降器頂部端口的流量只是蠕動泵控制的兩個流量之間的差異：1. 來自生物反應器的入口流量和 2. 從沉降器到生物反應器的返回流量。

可以從沉降器頂部流出流和沉降器底部返回流中取樣，以測量每個流中的細胞濃度和活力。我們還可以測量這兩個樣品以及生物反應器中細胞的大小分布，

以分析緊湊型細胞沉降器在選擇性地僅去除沉降器頂部流出物中的死細胞和細胞碎片方面的性能。

緊湊型細胞沉淀器選擇性地去除沉淀器頂部流出物中較小的死細胞和細胞碎片，但不會去除較大的活細胞。

在我們早期的哺乳動物細胞生物反應器實驗之一中，由于使用了有毒的消泡劑，我們在生物反應器中的細胞活力較低 (~50%)。由于生物反應器中的這種低細胞活力，

我們取樣并測量了生物反應器樣品中細胞的大小分布。我們可以在 8 到 10 微米的尺寸范圍內看到可識別的死細胞峰，以及較小尺寸范圍內的大細胞碎片尾巴。

當這種低活力細胞被泵入 6 英寸直徑的緊湊型細胞沉降器時，沉降器頂部流出物僅包含那些未在沉降器內沉降并在底部端口移除的細胞。

來自沉降器頂部流出物流的樣品顯示尺寸范圍為 8 – 10 微米的較大死細胞峰和較小尺寸范圍內的細胞碎片尾部。這些數據有力地表明，

我們的緊湊型細胞沉降器只能選擇性地去除較小的死細胞和細胞碎片。更重要的是，頂部流出物含有少的 15-30 微米尺寸范圍內的活細胞。

這種選擇性去除死細胞和細胞碎片是我們的緊湊型細胞沉降器（以及我們之前的傾斜層狀沉降器）的特之處，這是其他任何細胞保留設備所沒有的，

例如那些使用膜、離心機或聲學共振的設備誘捕方法。現在，憑借我們正在申請專li的緊湊型細胞沉降器，我們提供了與傾斜沉降器相同的選擇性去除死細胞的方法，

而且占地面積小得多（1/6）。

新型緊湊型細胞沉降器

緊湊型沉降器作為哺乳動物 (CHO) 細胞灌注生物反應器培養的選擇性細胞保留裝置可實現高細胞密度

在我們隨后的哺乳動物細胞實驗中，我們在生物反應器運行的兩周內，使用緊湊型細胞沉降器作為連接到生物反應器的選擇性細胞保留裝置，以相對大約 500 毫升/天的低灌注流量。

由于通過沉降器頂部流出物流選擇性去除死細胞和細胞碎片，生物反應器中細胞的存活率百分比保持高，或從十天內的約 80% 的值顯著增加到兩周內的約 90%。

在前兩周補料頁面培養物中存活率百分比的典型下降是單調的，或者由于補料分批生物反應器中死細胞的積累而根本無法逆轉。

隨著培養持續時間延長到三周，我們的灌注生物反應器的存活率百分比觀察到增加是使用沉降器（緊湊型或傾斜型）作為選擇性細胞保留裝置的一個特特征，

但在任何其他使用膜的總細胞保留裝置中沒有看到、離心機或聲學捕獲室。

選擇性去除沉降器頂部流出物中的死細胞和細胞碎片，幾乎完將活細胞從沉降器底部返回到生物反應器

三個流的尺寸分布測量，1. 從生物反應器到沉降器的入口流，2. 沉降器頂部流出物/收獲流和 3. 沉降器底部返回生物反應器可重復地表明 (a)

沉降器頂部流出物或收獲流包含只有死細胞和細胞碎片，但不含任何活細胞和生產細胞，并且 (b) 沉降器底部回流包含幾乎所有從生物反應器進入沉降器的活細胞和生產細胞。

來自臺盼藍排除測定的其他數據（此處未顯示）證實，沉降器底部回流中的細胞活力通常與生物反應器中的細胞活力相同，并且通常略高于生物反應器入口流中的細胞活力。

此外，留在沉降器頂部流出物中的細胞的活力低，證實大部分死細胞和細胞碎片留在流出物/收獲流中。與生物反應器和沉降器底部回流中的活細胞數量相比，

收獲流中的死細胞和細胞碎片數量大大減少（數個對數）。

緊湊型細胞沉降器