流動相被稱為HPLC系統的生命線，它起著至關重要作用：將樣品輸送通過分離柱，然后輸送至檢測器以鑒定分離出的成分。
流動相通常很少是單一的溶劑，它是水與有機溶劑相組合制成，比如水與極性溶劑的緩沖液或有機溶劑按所需比例混合組成。常用的兩種操作模式是：
等度洗脫—在等度模式下，流動相的組成在整個分析過程中保持不變。即混合物中溶劑的比例是預先確定的，并且在分析過程中只使用這一種流動相溶劑。
梯度洗脫—通過軟件以預定模式通過分析運行改變組成，運行結束時溶劑的比例與初始比例不同。
在進行色譜分析時，等度洗脫和梯度洗脫各有優勢和劣勢。使用不同溶劑混合物的目的是獲得所需的流動相極性，以實現樣品的*混溶，并控制樣品組分與固定相的相互作用，以在最短的時間內實現分離出的組分峰的所需分離度。
為了達到所需的目標，流動相應具有以下基本功能：
1、樣品應*溶于流動相。任何不溶的情況都會導致流量限制。注入系統之前，務必檢查樣品在流動相中的溶解度。
2、流動相成分應該是無毒無害的。它們不應對操作員構成健康危害。
3、流動相應對樣品成分和固定相呈惰性。任何反應都可能導致形成不溶的懸浮液，從而導致液相色譜柱堵塞。高效色譜柱一旦堵塞的話會造成峰寬展，對色譜柱的使用壽命也有影響。
一些肉眼無法看到的化學物質，也可能造成hplc色譜柱的堵塞。因此可以在色譜柱前添加一個保護柱，截留導致色譜柱篩板堵塞、柱頭塌陷和柱效下降的化學物質和顆粒物。
恒譜生色譜保護柱的卡套中內含保護柱芯，柱芯內含有硅膠填料。這些色譜填料的存在可以攔截樣品中的一些強保留、強酸性和強堿性物質，防止它們對色譜柱內填料的污染和損壞。uHPLCs恒譜生保護柱死體積少，在保護色譜柱的同時，對比于其他保護柱，它能夠大大減少柱外效應帶來的譜帶展寬；減少流路擴散，提高色譜柱分析靈敏度和分離度；更低的柱芯成本。因此使用液相色譜保護柱，可以對色譜柱進行保護，是保護色譜柱很好的方式。
4、與檢測器兼容性好，流動相在通過檢測器時不應給出自己的響應。換句話說，檢測器信號應僅反映樣品成分的響應。但是，這不適用于對包含洗脫化合物的流動相的整體折射率變化做出響應的整體性質檢測器，例如折射率檢測器。
5、粘度要低。因為高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。
HPLC技術在不同領域中具有廣闊的應用前景，越來越多的領域應用到各種HPLC技術。色譜操作員應該控制好操作條件（包括流動相的一致性）將確保結果的可重復性。
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