蘇州千舍生物提示細胞培養(yǎng)需注意哪些細節(jié)

養(yǎng)細胞是一件戳心戳肺的事情，你要像照顧小孩一樣仔細對待，愛護她，呵護她。如果你照顧的時候能注意這些問題，會讓你的細胞養(yǎng)的更好。下面就將養(yǎng)細胞的注意事項跟大家交流一下。

一、細胞培養(yǎng)前的準備

在您帶上手套開始細胞培養(yǎng)之前,先檢查一下移液管和瓶子的數(shù)量是否充足,以免在開始實驗后再次出入操作臺，這樣可以降低細胞污染的風(fēng)險。

細胞培養(yǎng)基也應(yīng)先預(yù)熱,選擇只預(yù)熱部分培養(yǎng)基而非整瓶加熱,不但可以節(jié)約實驗時間,而且可以避免因反復(fù)加熱培養(yǎng)基而造成的蛋白質(zhì)降解。

結(jié)束操作后,別忘了培養(yǎng)基對光敏感,應(yīng)盡可能避光保存。

二、細胞培養(yǎng)的定期檢查

定期檢查培養(yǎng)細胞的形態(tài)，即形狀和外觀，對于細胞培養(yǎng)實驗取得成功至關(guān)重要。

除確認細胞的健康狀態(tài)外，每次操作細胞時通過肉眼和顯微鏡檢查細胞還可早期發(fā)現(xiàn)污染征象，避免污染擴散至實驗室其他細胞。

三、細胞變質(zhì)的征象

細胞變質(zhì)的征象包括核周出現(xiàn)顆粒、細胞與基質(zhì)解離以及細胞質(zhì)空泡形成。

這些變質(zhì)征象可能為多種原因所致，例如：

培養(yǎng)物污染、細胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質(zhì)，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。

變質(zhì)嚴重時將會成為不可逆的變化。

四、細胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥的消毒及布局

保持細胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥內(nèi)的整潔有序，將所有物品置于直視范圍內(nèi)。

向放入通風(fēng)櫥內(nèi)的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔進行消毒。

在通風(fēng)櫥中部開闊處放置細胞培養(yǎng)容器；移液器置于右前方易于取用；試劑和培養(yǎng)基置于右后方便于吸??；試管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放廢液。

五、培養(yǎng)瓶/皿等物品的無菌操作

無菌培養(yǎng)瓶、試劑瓶、培養(yǎng)皿等物品使用時方可揭開蓋子，不得將其開放暴露于環(huán)境中，操作完成后盡快蓋上蓋子，取下蓋子時應(yīng)將蓋子開口朝下放在工作臺面上。

進行無菌操作時不要說話、唱歌或吹口哨。盡快完成實驗，以盡量避免污染。

Hyclone胎牛血清SH30084.03  、Hyclone胎牛血清SH30406.02  、Hyclone胎牛血清SH30406.05 、Hyclone胎牛血清SH30396.03  、Hyclone胎牛血清SH30070.03

特級胎牛血清 SH30070.03E 、Hyclone胎牛血清 SH30370.03  、活性炭/葡聚糖胎牛血清 SH30068.03  、活性炭/葡聚糖處理胎牛血清，熱滅活 SH30068.03HI 、馬血清SH30074.03  、烏拉圭胎牛血清 SV30087. 03 、Hyclone胎牛血清SH30071.03 、Hyclone胎牛血清SV30160.03。

BOVOGEN胎牛血清 SFBS 、BOVOGEN新生牛血清 SNCS。

PAA 普通胎牛血清FBS A15-101 、PAA 優(yōu)等胎牛血清FBS A15-151。

BI優(yōu)等胎牛血清 04-001-1ACS 、BI ES級別胎牛血清 04-002-1A 、

BI 間充質(zhì)胎牛血清 04-400-1A 。

Corning胎牛血清 35-076-CV。

PAN胎牛血清FBS P30-3302  、PAN胎牛血清FBS ST30-3302 、PAN ES級別胎牛血清 ST30-2602 、PAN胎牛血清Plus ST30-3302P 。

NTC優(yōu)等胎牛血清 SFBE。

Gemini優(yōu)等胎牛血清 900-108 、Gemini特級胎牛血清 100-500  、Gemini科研用人AB血清100-512 。

TCB胎牛血清 101ZC。

Sigma 特級胎牛血清F2442 、Sigma正常人AB血清 H4522 。

SBI 無外泌體血清 EXO-FBS-50A-1

胎牛血清盒裝A31608-02、馬血清16050-122。

雙抗15140-122、SV30010  、胰酶 25200-056、SH30042.01 、GIBCO 胰酶 25200-072。

MCF7/Taxol人乳腺癌紫杉醇耐藥株

HCT8/5-fu 人回腸直腸腺癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

LOVO/5-FU 人結(jié)腸癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

HCT116/L人結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥細胞

HL60/ADR人早幼粒急性白血病細胞耐阿霉素株

PC9GR(PC9R)人肺癌細胞耐吉非替尼

LOVO/ADR人結(jié)腸癌細胞阿霉素耐藥株

HNE1/DDP人鼻咽癌細胞順鉑耐藥株

SGC7901/5-fu人胃癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

A549/DDP人肺癌細胞順鉑耐藥株

MCF-7/DDP人乳腺癌細胞順鉑耐藥株

A549/ADR人肺癌細胞阿霉素耐藥株

SGC7901/DDP人胃癌細胞順鉑耐藥株

SKOV3/DDP人卵巢癌細胞順鉑耐藥株

HELA/DDP人宮頸癌耐順鉑細胞株

NCI-H1650 人肺支氣管癌細胞

RT4 人膀胱移行細胞乳頭瘤 、SK-N-MC 人神經(jīng)上皮瘤細胞

SK-N-SH 人神經(jīng)母細胞瘤細胞 、SW982 人滑膜肉瘤細胞

T98G 人膠質(zhì)母細胞瘤 、U251MG(KO) 人類星形膠質(zhì)細胞瘤細胞

U266 人骨髓瘤細胞 、VCAP 人前列腺癌細胞

hTERT-HPNE 人胰腺導(dǎo)管細胞 、ES-2 人卵巢透明細胞癌細胞

NCI-H1650人非小細胞肺癌細胞 、H460 人大細胞肺癌細胞

HACAT 人永生化角質(zhì)形成細胞 、HCT116 人結(jié)腸癌細胞

HEK293 人胚腎細胞  、HEPG2 人肝癌細胞

HGC27 人胃癌細胞(未分化) 、HT-29 人結(jié)腸癌細胞

HUVEC 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 、KYSE150人食道癌細胞

L02(HL7702)人正常肝細胞   、LOVO 人結(jié)腸癌細胞

MCF-10A人正常乳腺上皮細胞 、MCF7人乳腺癌細胞

LX-2 人肝星狀細胞 、MDA-MB-468人乳腺癌細胞

六、細胞培養(yǎng)中可能的污染物

細胞培養(yǎng)污染物主要分為兩類：

化學(xué)污染物,如培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑。

生物污染物，如細菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細胞系的交叉污染。

可通過充分了解污染源以及采用良好的無菌技術(shù)，降低污染發(fā)生的頻率和嚴重程度。

交叉污染的確認

交叉污染雖不如微生物污染普遍，但與HELA細胞及其他生長迅速的細胞系間廣泛的交叉污染是個明確的問題，會造成嚴重后果。

從聲譽好的細胞庫獲取細胞系、定期檢查細胞系性質(zhì)及采用良好的無菌技術(shù)有助于避免交叉污染。

通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認有無交叉污染。

七、細胞換液注意事項

為細胞換液時，要沿著培養(yǎng)瓶的一側(cè)輕輕地加入，而不是直接加到細胞中，以免損傷細胞，當(dāng)培養(yǎng)的細胞株較為脆弱時尤其需要注意。

使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時，每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。

八、細胞傳代的時間把握

當(dāng)細胞呈指數(shù)增殖，貼壁培養(yǎng)的細胞已占據(jù)所有可用基質(zhì)、沒有擴增空間，或懸浮培養(yǎng)的細胞已超過培養(yǎng)基質(zhì)所支撐的能力，無法進一步生長時，細胞增殖速度將大大降低甚至*停止。

為了將細胞密度維持在zui佳水平，以便細胞繼續(xù)生長，并且刺激進一步增殖，必須對細胞進行傳代。

九、細胞培養(yǎng)中使用抗生素的注意事項

細胞培養(yǎng)時不應(yīng)長期使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。

抗生素只能作為對付污染的zui后手段短期使用，并盡快撤除。

如果長期使用抗生素，則應(yīng)同時進行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對照。

十、細胞凍存的必要性

連續(xù)培養(yǎng)的細胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細胞系zui終會發(fā)生衰老，所有培養(yǎng)的細胞都易受到微生物污染，即使運轉(zhuǎn)情況zui好的實驗室也會遇到設(shè)備故障的問題。

由于已建立的細胞系是一種寶貴資源，更換細胞系成本高昂，而且耗費時間，因此，必須將其冷凍起來，長期保存。

十一、細胞凍存的事項

應(yīng)在細胞濃度高的情況下進行細胞培養(yǎng)凍存，并且細胞傳代的次數(shù)盡可能少。

在凍存前確保活細胞的百分比至少為90%。

請注意，zui佳凍存條件取決于所用細胞系。

凍存和復(fù)蘇過程對大多數(shù)細胞都會造成不利影響，因此不要通過渦旋震蕩或者用力敲打培養(yǎng)瓶的方法使細胞脫落（培養(yǎng)昆蟲細胞時除外），也不要高速離心細胞。

十二、凍存培養(yǎng)基的選擇

凍存細胞時必須選擇凍存培養(yǎng)基，凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有DMSO或者甘油等冷凍保護劑。

還可使用專門配制的*凍存培養(yǎng)基，例如HyClone、Gibco的細胞凍存培養(yǎng)基。

十三、細胞培養(yǎng)溫度的設(shè)定

細胞培養(yǎng)的zui佳溫度主要取決于細胞供體的體溫，此外也受到解刨部位體溫差異的影響，例如：皮膚溫度低于骨骼肌的溫度。

與溫度過低相比，細胞培養(yǎng)時溫度過高時更為嚴重的問題：因此，往往將培養(yǎng)箱的溫度設(shè)定為略低于zui佳溫度。

十四、各類細胞培養(yǎng)的zui佳溫度

大多數(shù)人和哺乳動物細胞系在36℃~37℃下具有zui佳生長狀態(tài)。

昆蟲細胞在27℃具有zui佳生長狀態(tài)；在低于27℃以及27至30℃范圍內(nèi)，細胞生長較慢。

溫度超過30℃時，昆蟲細胞活力降低，即使溫度降至27℃，細胞活力也無法恢復(fù)。

禽類細胞系在38.5℃時具有zui佳生長狀態(tài)。雖然此類細胞也可在37℃下培養(yǎng)，但其生長速度會變慢。

來源于冷血動物（例如：兩棲動物、冷水魚）的細胞系可耐受很寬的溫度范圍，為15-26℃。

請注意每種細胞的培養(yǎng)條件均有所不同，偏離某種細胞所需的培養(yǎng)條件會導(dǎo)致細胞表型異常，甚至培養(yǎng)*失敗。

因此，我們建議您應(yīng)熟悉自己使用的細胞系，實驗中嚴格遵守所有產(chǎn)品附帶的操作說明。

十五、細胞培養(yǎng)的zui適pH

大多數(shù)正常的哺乳動物細胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長良好，而且不同細胞株間差異極小。

但是，目前發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)化細胞系在輕度偏酸性的環(huán)境中即pH7.0-7.4時生長較好，而有些正常的成纖維細胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境即pH為7.4-7.7。

Sf9和Sf21等昆蟲細胞系zui適合在pH值為6.2的環(huán)境中生長。

十六、細胞培養(yǎng)基zui適pH的控制

細胞培養(yǎng)基可控制培養(yǎng)體系的pH值，為培養(yǎng)的細胞緩沖pH值的變化。

這種緩沖作用通常是通過添加有機緩沖鹽（例如：HEPES）或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽實現(xiàn)。

由于培養(yǎng)基的pH值取決于溶解態(tài)二氧化碳與碳酸氫鹽間的精密平衡，因此空氣中二氧化碳含量的變化會改變培養(yǎng)基的pH值。

為此，使用二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽培養(yǎng)基時必須使用外源性二氧化碳，特別是使用開放式培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞或者進行高濃度的轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)時。

十七、細胞培養(yǎng)中血清的保存

細胞培養(yǎng)中所用的血清不盡相同，您需要根據(jù)您所培養(yǎng)的細胞種類和培養(yǎng)要求來挑選出zui適合的血清。

我們建議將血清保存在-10至-20℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。

若您無法一次用完一瓶，建議您將血清無菌分裝至合適體積的滅菌容器內(nèi)，再放回冷凍箱保存。

解凍血清時，建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2-8℃冰箱過夜融解，然后在室溫下使之全融。需要注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。

十八、如何在細胞鋪板時避免“邊緣效應(yīng)”

細胞實驗鋪板時，為避免“邊緣效應(yīng)”，以應(yīng)用96孔板的中間60孔為zui佳，一般四周的一圈邊緣孔不養(yǎng)細胞，只做空白或陰性對照。

鋪板時，細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉淀下來而導(dǎo)致每孔中的細胞數(shù)量不等，可以每接幾個就再混勻一下。

加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。此外，吹散次數(shù)過多也會影響細胞活力。所以要熟練操作，盡快上板。

十九、何時選擇使用熱滅活血清

加熱血清可以滅活補體系統(tǒng)。

啟動的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，啟動淋巴細胞和巨噬細胞活化。

在免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。熱滅活血清可能出現(xiàn)的現(xiàn)象，在免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。而對于其他大多數(shù)的細胞來說是不需要熱滅活血清的。

熱滅活血清對細胞的生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚至可能因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率的降低；經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物會顯著地增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37度環(huán)境中，又會使此沉淀物增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

您可以根據(jù)您的研究需要選擇是否需要熱滅活血清。如此一來，不但能確保血清的質(zhì)量，而且能夠節(jié)省您寶貴的時間。

如何正確熱滅活血清，熱滅活時請將血清置于56℃水浴30分鐘。為盡量減少熱滅活對血清品質(zhì)的影響，一次滅活的血清體積不宜過大。

zui好準備同樣的容器裝相等體積的水（與血清相同溫度），滅活時將裝有血清和水的容器同時放入56℃水浴，在裝水的容器中放置溫度計，加熱過程中不時地輕輕旋轉(zhuǎn)混勻血清，當(dāng)溫度計顯示達到56℃左右，開始計時。