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蘇州千舍生物科技有限公司

千舍生物推薦ELISA實(shí)驗(yàn)

時(shí)間:2020-4-1閱讀:1232
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酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) ELISA

    一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡(jiǎn)稱ELISA)是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù),ELISA過(guò)程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為包被,加待測(cè)抗體(抗原), 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體(抗原),生成抗原(抗體)--待測(cè)抗體(抗原)--酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物,再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體(抗原)的量。待測(cè)抗體(抗原)的定量與有色產(chǎn)生成正比。


    二.實(shí)驗(yàn)原理
    用于免疫酶技術(shù)的酶有很多,如過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酯酶,β-D-半乳糖苷酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酐酶,乙酰膽堿酯酶,6-磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過(guò)氧化物酶,堿性磷酸酯酶等,其中尤以辣根過(guò)氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng),在呈色后須立刻測(cè)定,否則空氣中的氧化作用使顏色加深,無(wú)法準(zhǔn)確地定量。 
     辣根過(guò)氧化物酶(HRP)是一種糖蛋白,每個(gè)分子含有一個(gè)氯化血紅素(protonhemin)區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的大吸收峰是403nm,HRP酶蛋白的大吸收峰是275nm,所以酶的濃度和純度計(jì)算式是(已知HRP的A(1cm 403nm 1%)=25,式中1%指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g,即10mg/ml,所以,酶濃度以 mg/ml 計(jì)算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP純度(RZ)=A403nm/A275nm純度RZ(Reinheit Zahl)值越大說(shuō)明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右,可達(dá)3.4。用于ELISA檢測(cè)的HRP的RZ值要求在3.0以上。 

   ELISA的基本原理有三條: 
    (1)抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學(xué)活性;
    (2)抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性; 
    (3)酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后,可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在,而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的,因此,可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。 
    ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù),現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定,根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果,認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查,而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此,也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體,而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原,所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大,可概括四個(gè)方面: 1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。 2、研究抗酶抗體的合成。 3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。 4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。

基本方法一 用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法: 
  1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4℃過(guò)夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌,下同)。 
  2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔,陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。 
  3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小時(shí),洗滌。 
  4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘。 
  5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 
  6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽(yáng)性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)O•D值:在ELISA檢測(cè)儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O•D值,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽(yáng)性。 

基本方法二 用于檢測(cè)未知抗體的間接法: 
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml, 每孔加0.1ml,4℃過(guò)夜。次日洗滌3次。 
↓ 
加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照) 
↓ 
于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,后一遍用DDW洗滌。 
↓ 
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。 

     (二) 酶與底物
    酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑,它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng),還具有酶促反應(yīng),顯示出生物放大作用,但不同的酶選用不同的底物。
免疫技術(shù)常用的酶及其底物

酶        底物        顯色反應(yīng)        測(cè)定波長(zhǎng)
辣根過(guò)氧化物酶        鄰苯二胺        橘紅色        492*
        四甲替聯(lián)苯胺        黃色        460**
        氨基水楊酸        棕色        449
        鄰聯(lián)苯甲        蘭色        425
        2,2'-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽        藍(lán)綠色        642
堿性磷酸酯酶        4-硝基酚磷酸鹽(PNP)        黃色        400
        萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽        紅色        500
葡萄糖氧化酶        ABTS+HRP+葡萄糖        黃色        405,420
        葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭        深藍(lán)色        
β-D-半乳糖苷酶        甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)        熒光        360,450
        硝基酚半乳糖苷(ONPG)        黃色        420


     *  終止劑為2mol/L H2SO4
     ** 終止劑為2 mol/L檸檬酸, 不同的底物有不同的終止劑。
     可催化下列反應(yīng): HRP+H2O2→復(fù)合物 復(fù)合物+AH2→過(guò)氧化物酶+H2O+A AH2 ——為無(wú)色底物, 供氫體; A—— 為有色產(chǎn)物。

(三) ELISA常用的四種方法

    1.直接法測(cè)定抗原 
      將抗原吸附在載體表面;
      加酶標(biāo)抗體,形成抗原—抗體復(fù)合物;
      加底物。底物的降解量=抗原量。 

     2.間接法測(cè)定抗體
     將抗原吸附于固相載體表面;
      加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物;
      加酶標(biāo)抗體;
      加底物。 測(cè)定底物的降解量=抗體量。

    3.雙抗體夾心法測(cè)定抗原
     將抗原免疫一種動(dòng)物獲得的抗體吸附于固相表面;
     加抗原,形成抗原-抗體復(fù)合物; 
     加抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗體,形成抗體抗原抗體復(fù)合物;
     加酶標(biāo)抗抗體(第二種動(dòng)物抗體的抗體); 
     加底物。底物的降解量=抗原量。

    4. 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原
    將抗體吸附在固相載體表面;
     (1) 加入酶標(biāo)抗原;
     (2),(3)加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原;
     加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差=未知抗原量。 

    三.儀器和材料

    1. 聚苯乙烯微量細(xì)胞培養(yǎng)板(平板, 40, 96孔)。
    2. 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀
    3. 辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀釋度1:1000。
    4. 包被液::0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃,保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。
     5. 稀釋液:0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, 4℃,保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20,0.5ml. 蒸餾水加至1000ml。
     6. 洗滌液:同稀釋液
     7. 封閉液:0.5%雞卵清蛋白,pH7.4 PBS。
     8. 鄰苯二胺溶液(底物):臨用前配制 0.1M 檸檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml, 蒸餾水12.5ml, 鄰苯二胺10mg, 溶解后, 臨用前加30%H2O2 40 微升。
     9. 終止液:2mol/LH2SO4。 

    四.  操作步驟
    1. 包被抗原:用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋, 一般為1~10微克/孔,每孔加200微升,37℃溫育1小時(shí)后,4℃冰箱放置16~18小時(shí)。
    2. 洗滌:倒盡板孔中液體,加滿洗滌液,靜放三分鐘,反復(fù)三次,后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上,使孔中洗滌液流盡。
   3. 加封閉液200微升,37℃放置一小時(shí)。
   4. 洗滌同2。
   5. 加被檢血清:用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋,,每孔200微升。同時(shí)作稀釋液對(duì)照。37℃放置2小時(shí)。
   6. 洗滌同2。
   7. 加辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小時(shí)。
   8. 洗滌同2。
   9. 加底物:鄰苯二胺溶液加200ml,室溫暗處10--15分鐘。
   10. 加終止液:每孔50微升。
   11. 觀察結(jié)果:用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄490nm讀數(shù)。

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