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蘇州千舍生物科技有限公司

千舍支招:如何成為細胞培養高手?

時間:2020-6-9閱讀:996
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如何成為細胞培養高手?

問世間誰人無憂,唯*逍遙自在。

 

作為一名終日泡在實驗室的實驗君,

 

如何在細胞實驗中*,超脫輪回

 

做到一個人人羨慕的細胞大神呢?

 

且看向這里,成為細胞大神的六個細節。

1. 過濾體系

  自從出現瓶裝培養基之后,培養基過濾的需求就減少了。有些時候,一些特定細胞培養支持物的添加可能會引入一些新的污染。另外,一般認為,當液體長時間接觸瓶口外的空氣后重新過濾;所以一般不建議 管/瓶 對 管/瓶 的傾倒。這時,很多人會選擇Millipore的濾嘴配合針筒進行再過濾。結果發現,完成500 ml培養基過濾后,手疼腰酸!過濾杯的出現完美的解決了這個問題,所以,大體積盡量使用過濾杯吧,可靠且輕松,快捷。

2. 培養基的選擇

關于血清質量,業界流行的澳洲來源 > 北美來源 >南美來源的說法。這一點從價格上也可見一斑。實際情況是優質血清的市場現實是供不應求,所以很多時候大家就將就了之。如果有好的選擇,盡量使用澳洲來源的血清。

對于培養基而言,情況顯然是供大于求的,而且品牌甚多:Sigma,Gibco,Hyclone以及各種國產培養基等,當然一些國外廠商基于競爭及成本的考慮也推出了本土化的培養基。一些人認為培養基能用就行,反正細胞就在那里長著,也沒出現大規模的傷亡就忽視了培養基的重要性。但是,實驗是對完美的追求,多處將就會導致結果的將就,得不償失!從細胞培養的實際表現(活力,增殖周期,狀態等)看,*培養基 > 進口分裝培養基 > 大部分國產培養基。所以,別再將就培養基了!

3. 支原體檢測

  支原體污染和細胞培養機會形影不離,堪稱細胞培養的惡夢。前些年有報道說超過60%的實驗室的細胞存在細胞污染的現象。從早期表現看,支原體污染會讓你感覺不到,可能僅僅是細胞增速有些減緩;于是還是快樂的做的實驗,結果實驗數據不是很理想。事實是,支原體污染會影響細胞代謝,改變細胞功能等。

  藥典檢測支原體是培養法,時間以周記,這顯然不符合科研”快”的需求。PCR法應運而生,Sigma的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit,擴增的是支原體基因組上16S核糖體RNA基因。此區域高度保守,因此可檢測多達19種支原體。但是PCR后的電泳也是一件麻煩的事情,qPCR就是解決方案:LookOut Mycoplasma qPCR Detection Kit。

4. 胰酶的使用

胰酶適合大部多數細胞的消化:HEK293,CHO,HeLa等,而這類細胞我們往往將他定義為“糙”。當然,細胞本身肯定是不糙的,同樣相當金貴。只不過這些細胞對胰酶的耐受性好,一定濃度下的胰酶對細胞狀態影響不大。

有些細胞就非常金貴了,堪稱“嬌嫩”,比如:干細胞/">干細胞等,就不太適合利用胰酶進行消化。另外,如果消化組織進而分離細胞時使用胰酶也是值得小心的。一個好的解決方案是尋找一些溫和的替代品:Accutase、Accumax或EZ-LIFT。這些消化劑劑的特點是可替代胰酶,消化后無需用血清失活。尤其是EZ-LiFT™干細胞/">干細胞傳代試劑,這是一種無酶、化學成分限定的干細胞解離試劑,只選擇性傳代未分化的多能干細胞,避免人工進行群落篩選或細胞刮鏟的步驟,不需要使用ROCK抑制劑即可產生高細胞活性,還可以拯救高度分化的ips細胞培養物。

5. 細胞計數

細胞計數是細胞培養的日常。血球計數器、載破片、蓋玻片的組合折磨的每一個技術者的眼睛及耐心。所幸的是,一些公司根據血球計數的原理開發出了自動的計數儀,插入裝有細胞的蓋玻片即可。事實上,基于血球計數原理的另外一個問題是計數的準確性。一般認為CV可能在20%以上,這就非常糟糕了,打算加入10000個細胞,很可能計入了15000個細胞,這是不能接受的。

另外一個計數方法是基于庫爾特原理---類似與流式的方法,將細胞挨個數一遍。看到這個,可能想得是:這么大的一起,這么麻煩怎么做日常計數?Merck的做法是將這個設備小型化了:Sceptor,整體和一把1 ml移液槍類似。15秒內完成細胞技術且CV小于5%。

細胞計數器Sceptor及其數據呈現形式

6. 細胞凍存

細胞傳代過程中涉及細胞凍存。這么說其實是很有歧義的,嚴格意義上說獲得細胞系完成檢測后一件事就是大批量凍存細胞,而后開始進行該細胞相關實驗。常規來說,一株細胞的使用周期不宜過長,這樣能排除反復傳代過程中細胞生物學特性的改變。所以,很多時候他人惠贈的細胞系可能會存在傳代過多的問題,一個好的方案是從ATCC或ECACC(歐洲細胞庫)購買細胞,這些平臺的細胞背景干凈,傳代次數少。

DMSO是常用的細胞凍存保護劑,市面上品牌眾多,質量參差不齊。如果使用劣質DMSO凍存細胞,可能從實驗的一步開始就已經出了細胞品質不好的問題。推薦使用Sigma的DMSO,較多細胞凍存驗證的;或者直接使用其DMSO無血清細胞凍存培養基,確保細胞*。

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