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交叉污染雖不如微生物污染普遍,但與HELA細胞及其他生長迅速的細胞系間廣泛的交叉污染是個明確的問題,會造成嚴重后果。
從聲譽好的細胞庫獲取細胞系、定期檢查細胞系性質及采用良好的無菌技術有助于避免交叉污染。
通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認有無交叉污染。
血清與培養基
通常血清的添加比例為10%,當然也可根據細胞狀態和生長速率適當增加或減少添加比例。在更換血清品牌或者批次時,最好需對血清的品質進行驗證,防止對實驗造成影響。
對于培養基,目前商品化的比較成熟,穩定性也較好。如若需自配培養基時,過濾前攪拌時間不宜過長(培養基中營養豐富,細菌常溫下20min就可繁殖一代,其代謝產物會對培養細胞培養瓶
目前商品化的細胞培養瓶主要為瓶蓋是否帶氣孔兩種。其中不帶透氣孔細胞培養瓶擰緊后需適當回旋瓶蓋,保證CO2能順利進入細胞培養瓶。
細胞培養過程中,對于適應能力強的腫瘤細胞,可在傳代3-4次后更換新的細胞培養瓶。對于非腫瘤細胞系如293T,HEK293等細胞,建議每次傳代更換新的細胞培養瓶來保證細胞狀態。
細胞傳代
正常細胞形態較好,輪廓清晰,邊緣透亮,細胞增殖狀況良好。當貼壁細胞長到密度90%時,需進行傳代。
傳代時通常使用胰酶消化法。該方法又分為干消化法和濕消化法。
干消化法:胰酶浸潤后棄去胰酶,待細胞變圓后加入新鮮培養基吹下后再進行細胞傳代。
濕消化法:待細胞變圓,肉眼觀察下成流沙狀脫落時即可加入新鮮培養基終止消化,1000rpm離心5min,棄去上清,用新鮮培養基重懸傳代。
吹打細胞時,手法要輕柔,避免吹打出氣泡,造成細胞因內外壓差破裂,同時需避免刮到壁影響細胞的貼壁。
不同細胞的貼壁能力不同,消化時間不同;不同細胞細胞間連接強度不一樣,消化時間不同;同一細胞生長狀狀況不同,消化時間不同。消化時適時觀察細胞形態,避免因過度消化影響細胞活性。
傳代間隔時間和傳代比例因細胞而異。細胞傳代過程中,當細胞出現狀態不好或者污染時及時棄去細胞,重新復蘇。
細胞凍存與復蘇
當細胞生長狀況較好或者代數較早時,需及時大量的凍存。
細胞凍存液比例為培養基:血清:DMSO=7:2:1,也可血清:DMSO=9:1。細胞凍存密度通常為1-3×106個/ml。細胞凍存采用慢凍方式,減少冰晶形成,避免細胞損傷。通常4℃放置0.5 h,-20℃放置2 h,-80℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內。
細胞復蘇時升溫要快,防止在解凍過程中水分進入細胞,形成冰晶,影響細胞存活。38℃水浴不時搖動,在1分鐘內使其*融化,1000rpm離心5min,棄去上清,用新鮮培養基重懸移入培養瓶中。
用真誠感動細胞
俗話說,心誠則靈。對待細胞培養也應如此,“自己要用的細胞自己養",多去觀察細胞生長狀態。
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