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當(dāng)前位置:蘇州千舍生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>細(xì)胞傳代操作步驟
一、 貼壁細(xì)胞傳代(以一個(gè)T25瓶為例)
1、 吸出原培養(yǎng)液;
2、 加入2ml左右PBS,輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤(rùn)洗細(xì)胞,吸出PBS丟棄;
3、 加入1ml左右胰酶,輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之浸潤(rùn)所有細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱消化;
4、 消化時(shí)間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同,顯微鏡下看到細(xì)胞塊中間的細(xì)胞明顯分離變圓,側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時(shí)可終止消化,全程不要拍打培養(yǎng)瓶;
5、 加入3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化,吹打細(xì)胞使之脫落并在液體里反復(fù)吹打使細(xì)胞,使之盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液,這時(shí)可以在顯微鏡看下;
6、 收集細(xì)胞懸液離心,1200rpm(約250g) 3分鐘,離心完吸出上清丟棄。
7、 加入新鮮培養(yǎng)基,吹打幾下混勻細(xì)胞即可,按需接種到新培養(yǎng)瓶,補(bǔ)足培養(yǎng)基,擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)。
8、 檢查培養(yǎng)箱二氧化碳,溫度和水盤。
二、 懸浮細(xì)胞傳代(以一個(gè)T25瓶為例)
1、 輕輕吹散懸浮細(xì)胞,部分貼壁松散的懸浮細(xì)胞可直接吹打培養(yǎng)瓶底部使細(xì)胞懸浮,收集細(xì)胞懸液到無(wú)菌離心管中,離心1200rpm(約250g) 3分鐘,離心完畢吸出上清丟棄;
2、 加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按比例接種至培養(yǎng)瓶(接種比例按實(shí)際情況,不確定可計(jì)數(shù)后再接種);
3、 常規(guī)細(xì)胞推薦以3~5×105cells/ml傳代,長(zhǎng)到2×106cells/ml傳出;
4、 建議剛開(kāi)始幾代計(jì)數(shù)后傳代,后面可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)按比例傳代。
三、 半貼壁半懸浮細(xì)胞傳代(以一個(gè)T25瓶為例)
1、 培養(yǎng)液(含懸浮的細(xì)胞):用移液器吸出培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中;
2、 貼壁部分:用1ml PBS洗細(xì)胞,吸出PBS放入到第1步裝有培養(yǎng)液的離心管中收集(不要直接丟棄,里面有細(xì)胞);
3、 培養(yǎng)瓶加入胰酶1ml,放入培養(yǎng)箱靜置消化;
4、 消化時(shí)間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同,顯微鏡下看到細(xì)胞明顯收縮變圓,側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時(shí)可終止消化,全程不要拍打培養(yǎng)瓶;
5、 用3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化,將消化下來(lái)的細(xì)胞懸液吹散細(xì)胞后收集到第1步的離心管;
6、 將離心管在1200rpm(約250g) 3min離心,離心完畢棄掉上清,加入新的培養(yǎng)基重懸,按實(shí)際情況分瓶,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
溫馨提示:
1、 每丟棄一個(gè)液體前都要想一下里面有沒(méi)有可能有細(xì)胞,避免丟失細(xì)胞。
2、 細(xì)胞種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞狀態(tài)、甚至胰酶的品牌,均影響到細(xì)胞的消化時(shí)間,所以消化的時(shí)候不要只看時(shí)間,以顯微鏡下細(xì)胞的狀態(tài)來(lái)確定消化終點(diǎn),部分難消化的細(xì)胞消化時(shí)間甚至可以長(zhǎng)達(dá)15分鐘。
3、 細(xì)胞的傳代比例通常說(shuō)的是等體積的容器,不同容器需要換算;例如:一個(gè)T25培養(yǎng)瓶的細(xì)胞傳到一個(gè)10cm培養(yǎng)皿里面,雖然是1傳1,但是比例可不是1:1;T25瓶底面積25cm2,10cm培養(yǎng)皿底面積約為55cm2(10cm的培養(yǎng)皿指的是培養(yǎng)皿的外徑,而培養(yǎng)皿的內(nèi)徑約為8.4cm,故根據(jù)內(nèi)徑可求出其底面積為55cm2),所以實(shí)際傳代比例為1:2.2。
4、 在有關(guān)離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)中,標(biāo)準(zhǔn)的離心條件應(yīng)該是用RCF(relative centnifugal fieldt)來(lái)衡量,而在實(shí)際大家實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,往往習(xí)慣用rmp即每分鐘轉(zhuǎn)速來(lái)表示;RCF即表示相對(duì)離心場(chǎng),以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來(lái)表示;RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r(其中r表示離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心管中心的距離,單位為cm);所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置是不一樣的,常規(guī)建議1200rpm 大約250g。
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