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當(dāng)前位置:蘇州千舍生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>如何養(yǎng)出“漂亮“的懸浮細(xì)胞?
實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞種類可以大致分為貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞兩種,只有極少數(shù)類型細(xì)胞同時(shí)存在兩種狀態(tài)。
懸浮細(xì)胞是指不需要依賴支持物,可在培養(yǎng)基中以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)的一類細(xì)胞,如淋巴細(xì)胞和大部分血液系統(tǒng)來源細(xì)胞。(如小鼠白血病細(xì)胞WEHI-3, 人白血病細(xì)胞K-562, HL-60)。工業(yè)上也有越來越多的貼壁傳代細(xì)胞被馴化出來,進(jìn)行全懸浮的培養(yǎng)。目前在工業(yè)中應(yīng)用的主要有SP2/0、NS0、CHO、BHK和HEK293細(xì)胞等,它們主要用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn);在獸用生物制品中常用的傳代細(xì)胞主要有采用全懸浮培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞、MDCK細(xì)胞;及借助微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞、PK細(xì)胞、ST細(xì)胞、 Marc145細(xì)胞等,每種細(xì)胞的特性都不同。
一般情況下,懸浮細(xì)胞相較于貼壁細(xì)胞的處理更加簡(jiǎn)單一些,因?yàn)閼腋〖?xì)胞傳代時(shí)無須胰酶消化。但這并不意味著懸浮細(xì)胞比貼壁細(xì)胞好養(yǎng),對(duì)新手來說,反而更具挑戰(zhàn)性。總是會(huì)遇到各種各樣的問題:比如,為什么總是出現(xiàn)死細(xì)胞和細(xì)胞分化;說好了傳代很easy的,結(jié)果會(huì)出現(xiàn)分化;養(yǎng)好了凍存復(fù)蘇后又出現(xiàn)問題了!
接下來,我們一起探討一下關(guān)于培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的幾個(gè)要點(diǎn)吧:
要點(diǎn)一:足夠的耐心,這是非常必要的
很多懸浮細(xì)胞在剛從凍存狀態(tài)復(fù)蘇時(shí)活力是相對(duì)較差的,此時(shí)我們需要有足夠的耐心,等待細(xì)胞完成自我修復(fù)進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。比如THP-1(人單核細(xì)胞白血病)從解凍到恢復(fù)正常增殖往往需要7-10天的恢復(fù)期;Jurkat,Clone E6-1(人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞)復(fù)蘇后也需要5-7天才能恢復(fù)到凍存前的狀態(tài)。新手可能會(huì)在此期間放棄培養(yǎng),所以,請(qǐng)多一點(diǎn)耐心哦!培養(yǎng)這類細(xì)胞也是培養(yǎng)耐心的過程呢!
要點(diǎn)二:接種密度的把握
一般來說,懸浮細(xì)胞接種時(shí)密度不應(yīng)低于50萬(wàn)個(gè)/ML,很多懸浮細(xì)胞有密度依賴,密度低導(dǎo)致的不增殖也是新手常見問題之一。當(dāng)然,有極少數(shù)細(xì)胞在密度高時(shí)反而狀態(tài)變差,如W6/32(小鼠B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞)。因此,培養(yǎng)不了解的細(xì)胞前查找相關(guān)資料去掌握細(xì)胞特性非常重要,知己知彼,方能百戰(zhàn)不殆嘛!
要點(diǎn)三:換液方法及頻率
換液頻率不應(yīng)該被限制得“明明白白",細(xì)胞是活物,在一個(gè)連續(xù)培養(yǎng)周期內(nèi),視細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)可分多次添加補(bǔ)充培養(yǎng)基、葡萄糖等特定營(yíng)養(yǎng)成份,維持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。懸浮培養(yǎng)過程中,隨著細(xì)胞的增殖,原有培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗,代謝產(chǎn)物的增加,細(xì)胞的活率會(huì)下降,及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),使細(xì)胞處于一個(gè)相對(duì)良好的生存環(huán)境。這里就不再贅述,切忌頻繁離心換液。下面著重聊一聊換液方法:
①離心全換液法?
即通過離心(800-1000rpm,5min)去除全部舊的培養(yǎng)基,更換新鮮培養(yǎng)基。該方法適合“皮實(shí)“好養(yǎng)的懸浮細(xì)胞換液(如K562),或者當(dāng)前細(xì)胞狀態(tài)良好、密度較高導(dǎo)致培養(yǎng)基消耗較大的情況。此方法的優(yōu)點(diǎn)是換液*,能去除部分細(xì)胞碎片,但是同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的機(jī)械損傷。
②離心半換液法
即通過離心(800-1000rpm,5min)50%細(xì)胞懸液,更換50%體積的新鮮培養(yǎng)基。該方法適合比較“矯情“難養(yǎng)的細(xì)胞(如thp-1),或者正在調(diào)整狀態(tài)中、密度較低但碎片較多需要去除的情況。
③沉降換液法
即不使用離心機(jī)而是利用重力自然沉降的方法,將培養(yǎng)基與細(xì)胞分離,達(dá)到全部或部分更換新鮮培養(yǎng)基。但是其有應(yīng)用局限性—只適合能成一定大小細(xì)胞團(tuán)(否則無法自然沉降,只能低速離心)的細(xì)胞,尤其是處理依賴細(xì)胞聚集才能增殖的細(xì)胞時(shí)非常值得推薦,如NK-92、NK-92 MI、Jurkat。該方法能在換液過程中最大限度避免離心過程造成的機(jī)械損傷,同時(shí)保留聚集的細(xì)胞團(tuán),并且去除細(xì)胞碎片也較為*。
掌握了以上幾點(diǎn),再加上一株好的細(xì)胞種子,養(yǎng)出“漂亮“的懸浮細(xì)胞就指日可待啦!
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