您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)! 登錄| 免費注冊| 產(chǎn)品展廳| 收藏商鋪|
當前位置:蘇州千舍生物科技有限公司>>技術文章>>原代細胞培養(yǎng)注意事項
原代細胞培養(yǎng)注意事項
錯誤1:
一小管原代細胞在水浴中解凍一段時間。
糾正1:
原代細胞對解凍過程非常敏感,因此將小瓶置于37℃水浴中,保持并輕輕旋轉(zhuǎn)直到內(nèi)容物剛剛解凍是很重要的。然后應立即從水浴中取出小瓶,并轉(zhuǎn)移到無菌操作臺。確保您的培養(yǎng)瓶在解凍前已經(jīng)準備就緒,以便可以立即用于接種細胞,并置于培養(yǎng)箱中。
錯誤2:
解凍match小瓶后直接離心原代細胞。
糾正2:
我們不建議在解凍后離心細胞,因為離心程序比少量的DMSO殘留更有害。記住,在恢復原代細胞后的第二天更換培養(yǎng)基以去除任何殘留的DMSO。
錯誤3:
允許原代細胞變得過于融合。
糾正3:
當生長至100%匯合時,原代細胞可以變得衰老。記住,原代細胞不是100%純,因此重要的是盡量減少污染細胞的生長。我們建議在細胞達到90-95%融合時,對原代細胞進行傳代培養(yǎng)。
錯誤4:
傳代原代細胞時過度胰蛋白酶消化。
糾正4:
當細胞傳代時,使用低濃度的胰蛋白酶并在顯微鏡下密切監(jiān)測細胞。此外,記得在胰蛋白酶消化后中和細胞中的胰酶,因為任何活性的胰蛋白酶都將損傷細胞。
錯誤5:
原代細胞可以很容易地重新凍存。
糾正5:
通常我們不推薦重新凍存原代細胞,因為這可以促進細胞衰老和/或?qū)е鹿δ茏兓T毎浅C舾校匦聝鼋Y(jié)可能導致細胞死亡或損傷。
錯誤6:
原代細胞可以無限的增殖。
糾正6:
與細胞系不同,原代細胞具有有限的擴增能力。我們建議盡早使用原代細胞進行實驗以防止遺傳漂移。此外,如果你正在使用一個增值困難的細胞類型,你應該密切監(jiān)測細胞形態(tài),因為少量混雜的細胞(如成纖維細胞)可能隨著時間的推移,大量生長從而成為主要細胞。
錯誤糾正后就該步入正軌啦——
應如何進行凍存細胞的培養(yǎng)?
下列步驟以單管凍存細胞進行培養(yǎng)的實驗方案為例。
● 準備一燒杯37°C的水。
● 從液氮儲存中取出一管細胞,注意保護手和眼睛。
● 擰松管蓋1/4圈,等待10秒鐘以釋放螺紋中可能殘留的液氮,再重新擰緊管蓋。
● 將凍存管的下半部分置于37°C水浴中進行解凍,直至凍存管內(nèi)僅剩余一小塊冰芯,使細胞迅速解凍。
● 用消毒液擦拭管體外表面,再將其移至II級A型層流細胞培養(yǎng)通風櫥中。
● 打開管蓋,使用1 mL移液器上下吹打細胞懸液以分散細胞。
臺盼藍染色
● 從管中吸取20 uL細胞懸液,并將其稀釋于20 uL臺盼藍溶液中。
● 使用血細胞計數(shù)板來確定每毫升懸液中的活細胞數(shù)。
● 將管中懸液(1 mL)稀釋至產(chǎn)品說明中的推薦濃度。
● 將5 mL細胞懸液加入25 cm2培養(yǎng)瓶,或?qū)?5 mL細胞懸浮液加入75cm2培養(yǎng)瓶中。
● 搖勻培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基以分散細胞。許多類型的細胞都會迅速貼壁,如果沒有在傳代后即刻搖勻細胞,細胞可能生長不均勻。
● 在37°C、5% CO2/95%空氣、濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。為了獲得最佳結(jié)果,培養(yǎng)開始后至少在24小時之內(nèi)不要擾動細胞。
是否可以對擴增后的細胞重新凍存?如果可以該如何操作?
當從細胞庫購買的凍存或正處于增殖期的細胞,可對其進行擴增和重新凍存。不過,凍存操作可能會對細胞的生長狀態(tài)有所影響。下列實驗方案為大家提供了一份使用無蛋白成份的凍存培養(yǎng)基凍存細胞的基礎指南。
請注意:由于凍存設備與個人技術之間的差異,我們無法確保使用本方案凍存的細胞在復蘇后能夠保持活力,我們也無法為研究用戶實驗室凍存細胞的效果進行擔保。
● 使用37°C水浴化凍無蛋白成份的凍存培養(yǎng)基或4°C條件下過夜化凍。
● 如果在水浴中進行化凍,請確保溫度不要超過37°C,也勿將該產(chǎn)品延長時間置于37°C。
● 無蛋白成份的凍存培養(yǎng)基在使用前應置于4°C條件下平衡。為獲得優(yōu)結(jié)果,推薦大家使用能夠控制變溫速率的冰箱。如果缺少能夠控制變溫速率的冰箱,也可使用細胞凍存盒。
● 如需用酶試劑解離培養(yǎng)器皿表面的細胞,則需使用對應的終止溶液重懸細胞以中和酶的效果。
● 通過離心沉淀細胞。
● 去除上清液后,使用預冷的無蛋白成份的凍存培養(yǎng)基以5x10E5至3x10E6細胞/毫升的密度重懸細胞。
● 將細胞懸液分裝至合適數(shù)量的凍存管中。
● 將細胞盡快冷卻至4°C。
● 如果使用控制變溫速率的冰箱:以每分鐘降低1°C的速率冰凍樣品,直至–40°C。之后按照每分鐘降低2°C的速率降至–90°C左右。
● 如果使用細胞凍存盒:請按照說明書來準備凍存盒。
● 為獲得最佳結(jié)果,推薦大家在細胞溫度降至–80°C后,盡快將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮儲存設備的氣相中。
● 作為無蛋白成份的凍存培養(yǎng)基的替代品,可使用該凍存細胞推薦的基礎培養(yǎng)基,添加10%胎牛血清(FBS)和10% DMSO進行細胞凍存。
組織塊貼壁法分離細胞時:注意組織塊貼壁2-3h后,補液時沿壁輕輕加入培養(yǎng)基,防止組織塊漂浮。
特別提醒:
如果用血清培養(yǎng)原代細胞,那么需要用到更高級別的胎牛血清,特級胎牛血清,
千舍推薦:WinSera FBS500-WP-002、PAN ST30-2602、BOVOGEN 新西蘭SFBS
請輸入賬號
請輸入密碼
請輸驗證碼
以上信息由企業(yè)自行提供,信息內(nèi)容的真實性、準確性和合法性由相關企業(yè)負責,化工儀器網(wǎng)對此不承擔任何保證責任。
溫馨提示:為規(guī)避購買風險,建議您在購買產(chǎn)品前務必確認供應商資質(zhì)及產(chǎn)品質(zhì)量。