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蘇州千舍生物科技有限公司

類器官培養(yǎng)基操作指南(以肝癌為例)

時(shí)間:2023-3-23閱讀:962
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貨號(hào):WS010-100-KIT


品牌:WinSera


規(guī)格:100ml


操作步驟:
1、 原代


(1)取材后的肝癌組織須在 2 - 8℃含有組織保存液E的取樣瓶中,快速轉(zhuǎn)運(yùn)至潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織處理和干細(xì)胞分離,拍照并登記信息。

(2)準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿,加入 4℃預(yù)冷的肝癌類器官培養(yǎng)緩沖液 B備用

(3)取樣瓶消毒,將組織放入培養(yǎng)皿中,利用肝癌類器官培養(yǎng)緩沖液B清洗三次后,利用眼科剪或手術(shù)刀將腫瘤組織剪切成體積約為 1~3 mm3 的組織塊。

(4)組織用肝癌原代組織消化液C消化,37℃震蕩消化10-20 min,(消化過程中隨時(shí)觀察消化情況)。

(5)取少量液體在顯微鏡下觀察,鏡下觀察到較多的單個(gè)細(xì)胞或 70μ m 以下的細(xì)胞簇后,加入三倍體積肝癌類器官培養(yǎng)緩沖液B終止消化。

(6)使用100μm孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾,將濾液收集后,于300g富集離心5min后移去上清,添加肝癌類器官培養(yǎng)緩沖液B重新重懸離心。

(7)基質(zhì)膠計(jì)算:第6步后觀察收集到的組織體積,添加25倍組織體積的基質(zhì)膠重懸鋪板。

(8)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例,每孔點(diǎn)膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板(4℃下操作)。

(9)將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠,添加肝癌類器官培養(yǎng)基A(恢復(fù)室溫)進(jìn)行培養(yǎng)。

2、 類器官傳代培養(yǎng)


(1)移液器吸去培養(yǎng)基,每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液B放置2min。

(2)移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠,收集在15ml離心管中,4℃靜置10min。(每6-8孔為一組)

(3): 3.1類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí): 離心5min棄去上清,添加適量肝癌類器官緩沖液B重懸移入1.5ml離心管,300g離心5min棄去液體進(jìn)行第4步。 3.2類器官數(shù)量較多或體積較大時(shí):離心5min棄去上清,添加適量類器官傳代消化液D消化2-3min,添加肝癌類器官緩沖液B終止消化,離心5min棄去混合液,添加適量肝癌類器官緩沖液B重懸移入1.5ml離心管,300g離心5min棄去液體進(jìn)行第4步。

(4)類器官收集后,添加基質(zhì)膠重懸,每孔25μl基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,放置培養(yǎng)箱中10-15min添加500μl肝癌類器官培養(yǎng)基A。

3、類器官凍存


(1)移液器吸去培養(yǎng)基,每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液B放置2min。

(2)移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠,收集在15ml離心管中,4℃靜置10min。(每6-8孔為一組)

(3) 離心5min棄去上清,添加適量肝癌類器官緩沖液B再次重懸,300g離心5min棄去液體。

(4)添加適量類器官凍存液 F,輕柔吹打重懸,以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例:密度為2個(gè)孔凍存1管,每管體積1.4ml。

(5)做好標(biāo)記信息,進(jìn)行程序降溫后,移入液氮長期保存,

4、 類器官復(fù)蘇


(1)取10ml肝癌類器官培養(yǎng)緩沖液B于15ml離心管中

(2)從液氮罐中取出凍存的類器官細(xì)胞,快速置于 37℃水浴鍋中融解。

(3)水浴融解過程中,需輕輕搖動(dòng)冷凍管,以確保凍存液在 1-2 分鐘內(nèi)w全融解。

(4)將溶解后的類器官細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 離心管,使用移液管輕輕吹打6-8次,300g 離心 5分鐘,然后除去上清液并收集類器官細(xì)胞沉淀。添加適量肝癌類器官緩沖液B重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。

(5)基質(zhì)膠重懸,每孔25μl基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,放置培養(yǎng)箱中10-15min成膠,添加500μl肝癌類器官培養(yǎng)基A。

運(yùn)用范圍:

FOR LABORATORY RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES

培養(yǎng)圖片展示:



送樣要求及癌種


樣本的質(zhì)量將極大影響類器官培養(yǎng)的成功率和效率,因此建議客戶提供的樣本需符合以下幾項(xiàng)要求:

 

樣本類型與要求

新鮮胸腹液:  50~100 mL,低溫?zé)o菌保存。

手術(shù)樣品:  體積大于黃豆大小、越大越好,非纖維化激化灶(越大越好,于腫瘤邊緣,12點(diǎn)、3點(diǎn)、6點(diǎn)與9點(diǎn)方向,各取一塊),裝入公司專門取樣保持管,4度保存,標(biāo)明樣本信息,冷藏運(yùn)輸(48小時(shí)內(nèi))

穿刺樣品:長于2 cm,裝入樣品瓶,4度保存,標(biāo)明樣本信息,冷藏運(yùn)輸。

培養(yǎng)周期

3-4周

 


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