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類器官是能夠在體外三維培養,并表現出相應器官生物學特征的“最小系統"。隨著類器官培養技術的不斷進步,應用也越來越廣泛。關于類器官構建原理、培養等方面的問題解答,希望能夠對各位小伙伴有所幫助。
基礎篇
Q1: 類器官培養對于起始細胞的來源有要求嗎?
A1: 目前培養的類器官主要來源于上皮細胞,對于非上皮細胞來源的類器官培養方式還需要進一步研究。
Q2: 類器官按照起始細胞的類型,分為幾種呢?
A2: 常見的類器官根據起始細胞的類型,可以分為兩種:
(1)腫瘤組織來源的腫瘤類器官;
(2)干細胞來源的類器官,包括:多能性干細胞 (PSC) /成體干細胞 (ASC)以及誘導多能干細胞(iPSC)。
Q3: 類器官是由單一種類細胞組成的嗎?
A3: 類器官并不是單一細胞組成的結構,而是由具有干細胞性質的起始細胞進行分裂和分化,并將多種類型的細胞自組裝的結構,自組裝后的形態和功能與體內相應器官相似。
Q4:在沒有新鮮組織的情況下,可以用凍存組織提取的原代細胞進行3D培養嗎?
A4:可以的。已有學者驗證過,將人結腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術組織切碎后,以梯度降溫的方式進行冷凍,最終在液氮中保存15-18個月后進行復蘇和原代細胞提取,分別對細胞進行2D和3D培養,證實了凍存對于細胞活力和生長速度均無顯著影響【1】。
當然,由于組織來源不同、凍存條件不同,還需要大家根據實際情況進行驗證,新鮮組織提取的細胞依然是3D培養的選擇。
Q5:類器官可以像細胞一樣進行凍存和復蘇嗎?
A5:類器官可以凍存,通常會在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達到最佳的效果,可以選擇類器官成熟(傳代7-10次)后再進行凍存。
Q6:類器官的尺寸需要進行控制嗎?
A6:是的,主要的原因是類器官內部缺乏循環系統。
當類器官的尺寸較大時,靠近中心的細胞難以和外界進行氧氣和營養成分的交換。因此這個結構尺寸越大,死亡的細胞就越多(如圖1)【2】。我們在培養的過程中,需要控制類器官的大小在4-5mm以內。未來的類器官技術可以與血管類器官結合在一起,建立一個功能性的封閉循環系統,用以培養出更大尺寸的類器官。
圖1. TUNEL染色表明較大尺寸的類器官中心有大量細胞死亡(綠色),比例尺為100μm【2】
Q7:類器官傳代的標準是什么?
A7:類器官的傳代通常是根據培養的時間判斷。一般在7-14天時進行第一次傳代,后續則每7-10天傳代一次【3】。
Q8:類器官可以進行多少次傳代?
A8:大部分類器官可以在體外連續傳代10次(>6個月),甚至有些類器官可以連續傳代20次(>12個月)并且維持原有的生長速度【4】。
Q9: 鑒定類器官的方法有哪些?
A9: 初步可以通過顯微鏡和H&E染色觀察形態;然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術檢測該類器官是否表達相應的biomarker;基因測序可以鑒定所培養的類器官是否有某些特征丟失;對于部分類器官,還可以檢測其是否具有功能,例如:已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸,心臟類器官可以自主跳動。
Q10: 類器官是如何按照我們的意愿進行定向分化的?
A10: 在進行類器官培養前,我們需要了解該器官在體內的發育過程,及早期發育相關的信號通路。
以胃類器官培養為例:胃由前后腸發育而來,早期發育需要由多種信號通路共同調控。那么在體外我們需要通過添加細胞因子的方式,指導激活/抑制相應的信號通路,來達到相同的效果,如:PSCs在Activin A的作用下分化為內胚層,Wnt3a、FGF-4和Noggin指導細胞向向前腸分化【5】。
問:類器官原代培養的挺好的,一傳代就不行了是什么原因?
答:可能是傳代過程有樣本的丟失,因為基質膠重選后還是會有一些類器官在膠里,傳代的時候可以不用把基質膠wan全去除干凈,留一點。
問:除了T細胞,類器官還可以和哪些細胞共培養?
答:還可以和PBMC、成纖維細胞共培養
問:類器官復蘇的標準是什么?
答:類器官復蘇后,培養1周左右,可以正常進行傳代說明復蘇效果比較好。
問:類器官凍存的標準是什么呢?凍存需要多少類器官?
答:前5代建議是取2-3孔凍存為1管,1孔大概是20個類器官左右。
問:類器官鑒定的方法有哪些?
答:鑒定方式一是可以從組織層面進行,主要是組化鑒定;另外是分子層面,可以進行外顯子測序或者轉錄組測序等測序手段。
問:類器官培養成功的標準是什么呢?
答:目前還沒用一個統一的標準,一般類器官可以穩定傳代3代以上,說明干性是比較好的。
問:類器官長到多大可以做藥篩呢?
答:一般傳代后長到200-300um可以進行藥篩實驗
問:一個類器官試劑盒 可以養多少個類器官?
答:2-4個,100ml的培養基可以養200個孔。
問:類器官可以直接用細胞系培養嗎?
答:用細胞系培養的不能成為類器官,只能稱之為細胞球。
問:取材時為什么剔除脂肪組織?脂肪肝可以做類器官培養嗎?
答:脂肪組織影響后續消化分離得到的干細胞純度,脂肪肝也是可以做類器官培養的,消化前可以多清洗幾次,去掉表面脂肪。
問 :類器官培養一定需要基質膠嗎?
答:基質膠主要是為類器官提供支撐作用和營養物質,基質膠主要成分有laminin,collagen IV,heparan sulfate proteoglycans。
問:如果要做藥篩需要額外去除基質膠和培養基嗎?
答:和傳代培養鋪板一樣,藥用培養基稀釋就可以。
問:類器官量多小的時候不需要加消化液?
答:一般是100um以下。
問: 想要CTC培養,需要多少樣本量呢?
答:至少50+個CTC,取樣時可以多取一些血,CTC細胞占比比較少。
問:原代培養中消化下來的細胞是只有干細胞嗎?
答:消化下來的細胞包含各個種類的細胞,但是能培養成類器官的只有成體干細胞和腫瘤干細胞,沒有干性的細胞在培養過程中不會增殖分化,養的過程會死掉。
問:初始量樣本量10*5,活性大于90%,可以培養出多少類器官?
答:培養一代,一般是24孔板的10個孔。
問: 類器官培養一代需要多長時間?
答 :一般需要5-7天,長得快可3-5天。
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