WS-100Y人誘導型多能干細胞
細胞名稱:人誘導型多能干細胞
細胞貨號:WS-100Y
細胞描述:將人包皮細胞誘導成 iPS 細胞,通過重編程轉錄因子為:OCT4、SOX2、KLF4、
MYC 誘導建立 iPS 細胞,培養時無需飼養層細胞。形 態:球形克隆
來源性別:男性疾 病:健康
年 齡:新生兒
ATCC number: ACS-1011TM
凍存日期/代數:詳見 凍存管/培養瓶 標識建議復蘇培養體系:1 個 T25 培養瓶
細胞狀態:良好
支原體檢測結果:陰性
細胞用途:僅供科研使用。
iPS細胞wan全培養基培養人胚胎干細胞
1.試劑和材料
iPS細胞wan全培養基試劑盒
成分 | 規格 | 數量 | 儲存條件 |
iPS細胞基礎培養基 | 500mL | 1瓶 | 2-8℃ |
iPS細胞培養基添加劑 | 20mL | 1支 | -20℃ |
所需的其它試劑和材料
產品 | 規格 | 貨號 | 品牌 | |
Y27632 | 1mg | iPSMed-iCell-CA005 | ||
Matrigel | 5mL | iPSMed-iCell-CA004 | ||
iPS細胞消化液 | 500mL | iPSMed-iCell-CA003 | ||
ES細胞專用凍存液 | 100mL | iCell-0700-T | ||
另需細胞培養皿/瓶/板,15mL離心管和移液管等細胞培養耗材 |
2.培養流程
2.1試劑的制備
2.1.1 wan全培養基制備
2.1.1在室溫(15-25℃)或冰箱內(2-8℃)過夜解凍細胞培養基添加劑,可在無菌條件下將添加劑分裝為適量的工作等份,并在-20℃下凍存。冷凍的分量須在3個月內用完。解凍后的分量應該一天內制備成wan全培養基。請勿在解凍后再次冷凍。
2.1.2.在無菌條件下將20mL的添加劑全部解凍后加入到500mL的基礎培養基中,充分混勻。wan全培養基在(2-8℃)下儲存時刻維持穩定狀態最多2-3周,或在-20℃下冷凍時刻維持穩定狀態最多3個月。在室溫(15-25℃)或冰箱內(2-8℃)過夜解凍冷凍的培養基,不要長時間放在37℃水浴內加熱培養基。
如果在無菌條件下制備,細胞wan全培養基可直接使用。
2.1.2 Matrigel工作液的配制與包被
鑒于基質膠的操作環境要求比較嚴格,為保證您的實驗順利,特此對以下幾個方面進行溫馨提示:
1. 收貨時,首先確認還有干冰,Matrigel成固態,液面水平,如有異常請及時拍照取證并聯系我們。
2. 整個Matrigel只能分裝一次,在分裝前,要先放4℃冰箱(最好先把Matrigel插在冰上,然后放入4℃冰箱)過夜,且分裝用的槍頭、EP管等都要提前-20℃預冷(基質膠在10℃以上會發成膠凝固導致基質膠報廢),整個分裝過程都需在冰上進行,且以后每次試驗時拿出本次用量所需的基質膠。
3. 實驗人員手心不要接觸基質膠,如:要手持裝有Matrigel的EP管的上方,防止體溫使基質膠成膠凝固。
4. Matrigel的稀釋比例建議為100倍稀釋。
本庫建議的配制Matrigel工作液方法:
1. 稀釋前將Matrigel放入4℃冰箱過夜融化。
2. 將適量體積的稀釋液(DMEM/F12或PBS)置4℃冰箱預冷。
3. 將融化的Matrigel與稀釋液從冰箱中取出并打開蓋子,用移液管吹吸稀釋液幾次以冷卻移液管,并吸取少量稀釋液加入Matrigel管中混勻,將Matrigel轉移到稀釋液中,并吹打混勻。(因為Matrigel遇15℃以上溫度就會成凝膠粘在原裝玻璃壁和移液管壁上,故Matrigel從冰箱拿出來以后盡快打開蓋子并轉移到預冷的稀釋液中,吸取Matrigel的移液管一定要冷卻)。
4. 立即用稀釋后的Matrigel包被培養板或培養皿。對于6孔板,每個孔使用1mL稀釋后的Matrigel,對于6cm的培養皿,每個孔使用2mL稀釋后的Matrigel,晃動培養板使Matrigel溶液均勻的分布在表面上。
5. 使用前,包被的培養板應放在培養箱(37℃)下至少1h。請勿讓培養板脫水。在培養板可供使用之前,請勿移除Matrigel溶液。
如果不立即使用,培養板必須密封,以防止脫水。包被后的培養板可在2-8℃下最多儲存7天。
如果Matrigel溶液并未wan全覆蓋表面,則無法實驗最佳的細胞培養,因此,不建議使用含有溶液已蒸發區域的培養板。
如果已將培養板在2-8℃下儲存,則在移除Matrigel溶液之前,將培養板在培養箱(37℃)下放置30min。
2.1.3 Y27632的配制
Y27632粉末溶解在PBS中,配制成濃度未10mM的儲存液,0.22μm濾膜過濾除菌。分裝后冷凍于-20℃。
Y27632提高復蘇和傳代后的克隆形成率,所以只在復蘇和傳代步驟添加(1:1000,即終濃度為10μM),換液時不添加。
2.2.復蘇
在開始復蘇前,將所有試管、預熱后的培養基和培養皿準備好,已確保盡快完成復蘇過程。
將凍存管從液氮中取出,快速在37℃水浴槽中解凍,輕柔持續地搖動凍存管,直到只剩下一個小冷凍團。從水浴槽取出凍存管,70%乙醇擦拭進行消毒。
使用移液管將凍存管中含有iPS細胞的凍存液輕輕轉移至一個含有5-6mL已經預熱的wan全培養基的15mL離心管中,過程必須輕柔防止吹散細胞團。
室溫300g離心5min。
吸出培養基,確保細胞團完整。
然后緩慢加入1mLwan全培養基,用手指輕彈離心管底部,使細胞團脫離底部并分散。
輕輕的將此1mL細胞懸液轉移至已包被的培養皿/板/瓶,根據最終培養細胞的液體體積,加入ROCK inhibitor Y27632,終濃度為10μM。
將培養皿/板/瓶置于37℃培養箱中,每天更換培養基(換液不需要再添加Y27632,但培養基需提前預熱)。
2.3.傳代
當集落變得較大、中心變得密集、明亮(對比邊緣),相鄰的集落開始融合時,此時可進行傳代。
傳代前,準備 37 ℃預熱好的無鈣鎂PBS 溶液及消化液,wan全培養基。
吸走上清,并加入37℃預熱好的PBS 溶液清洗1次。
加入適量(按 6 孔板每孔加 1mL,6cm 皿加 2mL,10cm 皿加 3mL 的量)的 37℃預熱好的消化液。
37℃放置1-2min,用手指輕彈皿/板/瓶身,顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養皿/板底,克隆內部大部分細胞成團脫落。
加入適量的wan全培養基終止消化。
移入離心管,300g離心5min。
離心后重懸(重懸步驟參照復蘇4-5步)。
傳代比例為 1:6—1:8,根據最終培養細胞的液體體積,加入ROCK inhibitor Y27632,終濃度為10μM。
將培養皿/板/瓶置于37℃培養箱中,每天更換培養基(換液不需要再添加Y27632,但培養基需提前預熱)。
2.4.凍存
當集落變得較大、中心變得密集、明亮(對比邊緣),相鄰的集落開始融合時,此時可進行傳代。
傳代前,準備37 ℃預熱好的無鈣鎂 PBS 溶液及消化液,wan全培養基。
吸走上清,并加入37℃預熱好的 PBS 溶液清洗1次。
加入適量(按 6 孔板每孔加 1mL,6cm 皿加 2mL,10cm 皿加 3mL 的量)的 37℃預熱好的消化液。
37℃放置1-2min,用手指輕彈皿/板/瓶身,顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養皿/板底,克隆內部大部分細胞成團脫落。
加入適量的wan全培養基終止消化。
移入離心管,300g離心5min。
離心后重懸(重懸步驟參照復蘇4-5步)。
使用預冷的凍存液輕輕的重懸細胞團,然后將細胞懸液轉移至凍存管,凍存按 6 孔板每孔凍 1 支,6cm 皿凍 2-4 支,10cm 皿凍 6-12 支。
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