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細胞收到后注意事項
1、收到細胞,請查看瓶子是否有破裂,培養(yǎng)基是否漏出,是否渾濁,如有請盡快聯(lián)系
2、收到細胞,如包裝完好,請在顯微鏡下觀察細胞。,由于運輸過程中的問題,細胞培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞有可能從瓶壁中脫落下來,顯微鏡下觀察會出現(xiàn)細胞懸浮的情況,出現(xiàn)此狀態(tài)時,請不要打開細胞培養(yǎng)瓶,先不要把培養(yǎng)基吸出來。應(yīng)立即將培養(yǎng)瓶置于細胞培養(yǎng)箱里靜止3-5小時左右,讓細胞先穩(wěn)定下,再于顯微鏡下觀察,此時多數(shù)細胞會重新貼附于瓶壁。如細胞仍不能貼壁,請用臺盼藍染色法鑒定細胞活力,如臺盼藍染色證實細胞活力正常請按懸浮細胞的方法處理
3. 收到細胞時如無異常情況 ,請在顯微鏡下觀察細胞密度,如為貼壁細胞,未超過80%匯合度時,用75%酒精(建議配置75%酒精的水也是滅菌超純水。噴灑整個瓶消毒后放到超菌臺內(nèi),嚴(yán)格無菌操作:然后打開蓋子,先用槍頭把培養(yǎng)基吸出10ML左右,放在離心管里,然后瓶口過火,(嚴(yán)禁直接傾倒),這樣可以保證不污染,再用10ML的移液管,將剩余的培養(yǎng)基全部吸出,放于離心管中,培養(yǎng)瓶中只剩余5-10ML左右培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)就可以了):超過80%匯合度時,請按細胞培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng)。
如為懸浮細胞,吸出培養(yǎng)液,1000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-5分鐘,吸出上清,管底細胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮細胞后移回培養(yǎng)瓶。
4,將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),蓋子微微擰松。吸出的培養(yǎng)基可以保存在滅菌過的瓶子里,存放于4℃冰箱,以備不時之需。第二天換液時,要配制新鮮的培養(yǎng)基和進口胎牛血清。這樣對細胞生長更好。不要再用我們原瓶的培養(yǎng)基了。
5 、24小時后,細胞形態(tài)已恢復(fù)并貼滿瓶壁,就可以傳代了。(貼壁細胞)將培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)基倒去,加3-5ml(以能覆蓋細胞生長面為準(zhǔn))PBS或Hanks’液洗滌后棄去。加0.5-1ml 0.25%含EDTA的胰酶消化,消化時間以具體細胞為準(zhǔn),一般1-3分鐘,不超過5分鐘。可以放入37℃培養(yǎng)箱消化。輕輕晃動瓶壁,見細胞脫落下來,加入3-5ml培養(yǎng)基終止消化。用移液管輕輕吹打瓶壁上的細胞,使之wan全脫落,然后將溶液吸入離心管內(nèi)離心,1000rpm/5min。棄上清,視細胞數(shù)量決定分瓶數(shù),一般一傳二,如細胞量多可一傳三,有些細胞不易傳得過稀,有些生長較快的細胞則可以多傳幾瓶,以具體細胞和經(jīng)驗為準(zhǔn)。(懸浮細胞)用移液管輕輕吹打瓶壁,直接將溶液吸入離心管離心即可。
6,貼壁細胞 ,懸浮細胞。嚴(yán)格無菌操作。換液時,換新的細胞培養(yǎng)瓶和換新鮮的培養(yǎng)液和進口胎牛血清,37度 5%CO2 培養(yǎng)
7. 收到細胞后,請鏡下觀察細胞,用恰當(dāng)方式處理細胞。若懸浮的細胞較多,請離心收集細胞,接種到一個新的培養(yǎng)瓶中。棄掉原液,使用新鮮配制的培養(yǎng)基,使用進口胎牛血清. 剛接到細胞,若細胞不多時 血清濃度可以加到15%去培養(yǎng)。若細胞迏到80%左右 ,血清濃度還是在10%。
胰蛋白酶消化;
加入消化液:小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBS清洗(沖洗),加入適量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以蓋住細胞最好,最佳消化溫度是37℃。顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若胞質(zhì)回縮,細胞之間不再連接成片,表明此時細胞消化適度。吸棄消化液加入培養(yǎng)液:棄去胰蛋白酶液,注意更換吸管,加入新鮮的培養(yǎng)液。
吹打分散細胞:
吹打制懸:用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。吸細胞懸液入離心管:將細胞懸液吸入10ml離心管中.平衡離心:平衡后將離心管放入臺式離心機中,以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。棄上清液,加入新培養(yǎng)液:棄去上清液,加入2ml培養(yǎng)液, 用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。
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