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ScienCell胎牛血清(0500)

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ScienCell胎牛血清(0500)

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千舍生物開工大吉,干細胞專用,特級胎牛血清*......

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1. 如何選用特殊細胞系培養基?

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEMM199中同樣很容易生長。總之,選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始。

2. 何時須更換培養基?

視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。

3. 可否使用與原先培養條件不同之培養基?

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。

可否使用與原先培養條件不同之血清種類?

不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

培養細胞時應使用5 % 10% CO2?或根本沒有影響?

一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統,而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養時應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養細胞。

7.Hank's 蛋白酶(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank's 蛋白酶(HBS)Earle's蛋白酶(EBS)有什么本質的功能差別?

HBSEBS 的主要差別在于氫鈉的水平,Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。

8. 細胞之接種密度為何?

依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

9. 懸浮性細胞應如何繼代處理?

一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時, 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。

10.冷凍管應如何解凍?

取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。

11. 細胞冷凍管解凍培養時, 是否應馬上去除DMSO

除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

12. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會。

13.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?

欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (1,000rpm)5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。

14. 細胞冷凍培養基之成份為何?

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?

冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture gradeDMSO (Sigma D2650),其本身即為無菌狀況, 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO Nylon 材質濾膜。

16.冷凍保存細胞之方法?

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。

17. 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?

冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

18.培養基中是否須添加抗生素?

除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態下, 培養基中不應添加任何抗生素。

19.應如何避免細胞污染?

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染好方法。

20.如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?

原則上:直接滅菌后丟棄之。

當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如霉素b和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。

1.在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。

2.分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,霉素b推薦下列濃度,0.250.501.02.04.0,8.0 mg/ml

3.每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。

4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度23倍濃度的抗生素的培養液培養細胞23代。

5.在無抗生素的培養基中培養細胞一代。

6.重復步驟4

7.在無抗生素的培養基中培養46代,確定污染是否以已被消除。

21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞,是否能以肉眼觀察出異狀?

不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨之。

22.支原體污染會對細胞培養有何影響?

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數, 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。

23. 偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理?

直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。

24. CO2 培養箱之水盤如何保持清潔?

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

25.為何培養基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會偏暗紅色, 且pH值會越來越偏堿性?

培養基保存于4 °C 冰箱中, 培養基內之CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果,將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時,可以通入無菌過濾之CO2, 以調整pH 值。

26. 各種細胞培養用的dishflask是否均相同?

不同廠牌的dish flask, 其所coating polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對大部分細胞沒有太大之影響,惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish flask 而有顯著之生長差異。

27. 購買之細胞冷凍管經解凍后,為何會發生細胞數目太少之情形?

研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少, 大都是因為離心過程操作上的失誤,造成細胞的物理性損傷, 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心, 應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

28.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?

研究人員在細胞培養時出現存活率不佳, 常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。

29. 收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?

冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

30.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?

L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

31.GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解。

32.什么培養基中可以省去加酚紅?

酚紅在培養基中用作PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。

33.如何用臺盼蘭計數活細胞?

用無血清培養基把細胞懸液稀釋到2002000/毫升,在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭,因而染成藍色細胞是死細胞。

34.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

35.二價離子抑制蛋白酶活性嗎?使用蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?

二價離子的確抑制蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制蛋白酶的活性。建議蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。

06、培養基到底要不要加抗生素?

除于特殊篩選系統中外,一般正常培養狀態下,培養基中不應添加任何抗生素。如果是沒有進行過細胞培養的新手,對無菌技術沒有信心的,或者提取的原代細胞,怕污染的,可以適量添加抗生素。抗生素本身也是有毒性的,有些抗生素的藥效濃度水平與毒效濃度水平非常接近,對細胞多少有傷害。

07、培養箱二氧化碳使用比例如何判定?

一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統,而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7g時,細胞培養時應使用10%CO2;當培養基中NaHCO3為每公升1.5g時,則應使用5CO2培養細胞。

08L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?

L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

09、培養基里的粉紅色是什么?

酚紅一般作為培養基中pH值的指標:當培養基呈中性時為紅色,呈酸性時為黃色,堿性時為紫色。另外,酚紅可以模擬類固醇激素(特別是雌激素)的作用。如果要避免類固醇反應,可以在無酚紅的培養基里進行培養。

10、胰酶里EDTA的作用?

二價的離子會抑制胰酶活性,所以加入EDTA可以螯合掉CaMg這樣的二價離子。胰酶也要注意不要反復凍融。

11、如何避免細胞培養過程中的污染?

主要還是考慮無菌環境,盡量做好操作臺的滅菌,別把培養基滴落在生物安全柜的入風口,別在培養箱里把培養基打翻。這兩個地方霉菌一旦滋生,那你就只能等著用甲醛熏蒸了。

紫外無法殺滅霉菌,酒精也不行,只能用甲醛熏蒸,但是一定要注意安全。復蘇的時候,水浴鍋也需要進行滅菌處理。一旦出現污染,不要急,能救的就用抗生素救一下,但是一般情況下,選擇扔掉。避免交叉感染,要不只能整個實驗室消毒了。

ScienCell胎牛血清(0500

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