細(xì)胞名稱:雞胚胎成纖維細(xì)胞
UMNSAH/DF-1
細(xì)胞培養(yǎng)條件:DMEM(含NAHCO3 1.5g/L)+10%FBS+1%P/S 39℃培養(yǎng)
生長狀態(tài):貼壁生長
細(xì)胞是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要材料,也是生物細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ),藥物、基因功能、疾病機(jī)理等的相關(guān)研究多數(shù)需要在細(xì)胞水平進(jìn)行闡釋。而細(xì)胞培養(yǎng),受人員操作和環(huán)境條件的影響比較大,在細(xì)胞培養(yǎng)中常常會(huì)遇到很多的細(xì)節(jié)問題,而每個(gè)問題都有可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的失敗。我們匯總了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室多年來的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)分享給大家,希望能給大家的細(xì)胞培養(yǎng)帶來幫助。
一.細(xì)胞系身份需明確
我們之所以選定某種細(xì)胞系開展實(shí)驗(yàn),是因?yàn)樗x細(xì)胞系的一些特性符合研究方向的設(shè)定。比如組織特性,疾病特性,功能特性,基因表達(dá)特性等。一旦用錯(cuò)了細(xì)胞株,對(duì)我們研究結(jié)果的判斷就會(huì)帶來很大的誤差和不確定性。
而近年來,多個(gè)機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系在培養(yǎng)和流通過程中,出現(xiàn)了很嚴(yán)重的交叉污染。據(jù)不*統(tǒng)計(jì),單就HeLa細(xì)胞系導(dǎo)致的污染致使3萬多篇論文結(jié)果的準(zhǔn)確性存在問題(doi:10.1371/journal.pone.0186281)。而這種情況不僅僅限于HeLa細(xì)胞。多個(gè)機(jī)構(gòu)研究人員檢測發(fā)現(xiàn)超過451個(gè)細(xì)胞系已被其它細(xì)胞*吸收,在所檢測細(xì)胞中污染占比46%,可見細(xì)胞交叉污染的現(xiàn)象非常普遍。因此,做實(shí)驗(yàn)前對(duì)細(xì)胞株驗(yàn)明正身非常重要。如果是在機(jī)構(gòu)購買的細(xì)胞株,最好能讓供方提供合格的STR鑒定報(bào)告。
目前,STR基因分型方法是進(jìn)行細(xì)胞交叉污染和性質(zhì)鑒定的*和準(zhǔn)確的方法之一,是ATCC等機(jī)構(gòu)認(rèn)定的金標(biāo)準(zhǔn)。不過可惜的是并非所有細(xì)胞均可進(jìn)行STR鑒定,目前只有大部分的人源細(xì)胞株和45個(gè)種類的小鼠細(xì)胞株可以進(jìn)行鑒定。其他細(xì)胞株可以結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、特性和物種鑒定來進(jìn)行確認(rèn)。
二.培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇
1.準(zhǔn)備工作:
根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特性,提前準(zhǔn)備好適合的培養(yǎng)基和血清等。最好沿用細(xì)胞原來的培養(yǎng)條件,以免細(xì)胞在新環(huán)境下還需要過渡適應(yīng)。同時(shí),充分了解到細(xì)胞的生長特性和形態(tài)特征,便于后續(xù)的培養(yǎng)觀察。
2.貼壁細(xì)胞傳代:
1)移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)液。(不要直接倒掉,避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染)
2)使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液(PBS)沖洗細(xì)胞。從與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液,以避免攪動(dòng)細(xì)胞層,前后搖晃容器數(shù)次,最后移棄沖洗液。(洗去殘留的血清,避免影響胰酶的活性。)
3)以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例,向瓶內(nèi)加入1ml胰蛋白酶-EDTA(請(qǐng)根據(jù)各細(xì)胞的指引使用合適的濃度)消化液,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,使消化液流遍所有細(xì)胞表面,放到37 ℃ 孵育。通常,幾分鐘內(nèi),會(huì)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大,傾斜培養(yǎng)瓶時(shí)細(xì)胞層能自然流下,此時(shí)應(yīng)加入2-3ml含血清的*培養(yǎng)液終止消化(細(xì)胞解離所需時(shí)間請(qǐng)參考各細(xì)胞的指引,并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細(xì)胞的解離情況)。另外,并不是所有貼壁細(xì)胞都適用采用胰蛋白酶進(jìn)行解離,請(qǐng)根據(jù)各細(xì)胞的指引選擇合適的解離方法。
4)使培養(yǎng)瓶傾斜,吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體輕輕沖向原細(xì)胞生長表面,重復(fù)該動(dòng)作2-3次,使所有細(xì)胞沿瓶底流下,再輕柔地把細(xì)胞吹打成單個(gè)懸液(吹打過程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生)。
PS:對(duì)于難消化的細(xì)胞,盡量不要通過用力吹打的方式來處理,以免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生物理損傷。可以先將已經(jīng)消化的細(xì)胞分出來,及時(shí)終止消化。然后再對(duì)仍然貼壁的細(xì)胞進(jìn)行再次消化。做到分層消化,避免易消化細(xì)胞長時(shí)間在胰酶消化下受損。
5)把所有的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。
6)加入新的含血清*培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞懸液。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例,把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中,補(bǔ)足新的含血清*培養(yǎng)液,輕輕搖晃混勻。
7)放到37 ℃ 孵育,第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁情況。
3.懸浮細(xì)胞傳代:
因懸浮生長細(xì)胞不貼壁,故傳代時(shí)不必采用酶消化方法,而可直接傳代或離心收集細(xì)胞后傳代。
1)直接傳代時(shí),靜置5-10分鐘,待懸浮細(xì)胞慢慢沉淀到器皿底部后,吸掉1/2-2/3原培養(yǎng)液,補(bǔ)足新鮮的含血清*培養(yǎng)液,混勻成細(xì)胞懸液。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例,把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中,輕輕搖晃混勻。
2)離心傳代時(shí),將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),800-1000rpm離心3-5分鐘,移棄上清后,加入新鮮的含血清*培養(yǎng)液重懸。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例,把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中,補(bǔ)足新鮮的含血清*培養(yǎng)液,輕輕搖晃混勻。
3)放到37 ℃ 孵育,第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況。
4.貼壁懸浮混合型細(xì)胞傳代:
先將懸浮的細(xì)胞收集,再參考“貼壁細(xì)胞傳代"方法進(jìn)行消化收集,一起接種到培養(yǎng)器皿中。
PS: 懸浮細(xì)胞生長中一般對(duì)細(xì)胞密度要求比較高,培養(yǎng)中最好參考指南控制好細(xì)胞密度,不能過密也不能過稀。
5.細(xì)胞凍存:
1)按照“細(xì)胞傳代步驟"中的方法收集細(xì)胞。
2)加入細(xì)胞凍存液(一般10%DMSO+對(duì)應(yīng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液),使細(xì)胞的終密度為(5~10)×105個(gè)/ml,移入細(xì)胞凍存管中。
3)程序降溫(以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例):4℃ 30min→-80℃過夜→液氮。(一定不能省略4℃的30min,否則凍存液無法滲透到細(xì)胞,易產(chǎn)生冰晶導(dǎo)致細(xì)胞受損。)
6.細(xì)胞復(fù)蘇:
1)取出貯存的細(xì)胞,待液氮揮發(fā)后,馬上37℃水浴中輕輕搖動(dòng)使快速融化(通常2min內(nèi),時(shí)間長了細(xì)胞狀態(tài)會(huì)受影響)。為避免劇烈的溫差變化導(dǎo)致凍存管炸裂,操作該步時(shí)請(qǐng)配戴防護(hù)面罩或防護(hù)目鏡。
PS:干冰運(yùn)輸?shù)膬龃婕?xì)胞,收到后需要立刻放入深低溫冰箱或液氮中,至少3d后再進(jìn)行復(fù)蘇操作。
2)轉(zhuǎn)移到無菌操作臺(tái),75%酒精擦拭凍存管外部。
3)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10-20ml經(jīng)預(yù)熱的含血清*培養(yǎng)液離心管中,800-1000rpm離心3-5分鐘,移棄上清。
4)重新加入經(jīng)預(yù)熱的含血清*培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,以約(3~5)×105個(gè)/ml密度接種到培養(yǎng)器皿中。
5)放到37℃孵育,第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況。
大鼠 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
大鼠 肺動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞
大鼠 II型肺泡上皮細(xì)胞
大鼠 氣管上皮細(xì)胞
大鼠 氣管平滑肌細(xì)胞
大鼠 支氣管上皮細(xì)胞
大鼠 支氣管平滑肌細(xì)胞
大鼠 肺成纖維細(xì)胞
大鼠 肺巨噬細(xì)胞
大鼠 肺微血管周細(xì)胞
大鼠 心肌細(xì)胞
大鼠 心肌成纖維細(xì)胞
大鼠 主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
大鼠 主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞
大鼠 冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
大鼠 頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
大鼠 腹腔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 腹腔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
大鼠 腹腔主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞
大鼠 股動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
大鼠 心肌干細(xì)胞
大鼠 主動(dòng)脈弓平滑肌細(xì)胞
大鼠 主動(dòng)脈弓內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 頸動(dòng)脈成纖維細(xì)胞
大鼠 頸靜脈內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞
大鼠 食管上皮細(xì)胞
大鼠 食管平滑肌細(xì)胞
大鼠 食管成纖維細(xì)胞
大鼠 胃粘膜上皮細(xì)胞
大鼠 胃平滑肌細(xì)胞
大鼠 胃成纖維細(xì)胞
大鼠 小腸黏膜上皮細(xì)胞
大鼠 小腸平滑肌細(xì)胞
大鼠 小腸隱窩上皮細(xì)胞
大鼠 小腸成纖維細(xì)胞
大鼠 結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞
大鼠 結(jié)腸平滑肌細(xì)胞
大鼠 結(jié)腸成纖維細(xì)胞
大鼠 膽囊上皮細(xì)胞
大鼠 肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞
大鼠 肝外膽管上皮細(xì)胞
大鼠 肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞
大鼠 肝星狀細(xì)胞
大鼠 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 肝Kupffer細(xì)胞
大鼠 結(jié)腸神經(jīng)元細(xì)胞
大鼠 肝間質(zhì)細(xì)胞
大鼠 肝成纖維細(xì)胞
大鼠 腸間質(zhì)細(xì)胞
大鼠 腎小管上皮細(xì)胞
大鼠 腎小球系膜細(xì)胞
大鼠 腎小球內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 腎足細(xì)胞
大鼠 輸尿管上皮細(xì)胞
大鼠 輸尿管平滑肌細(xì)胞
大鼠 膀胱上皮細(xì)胞
大鼠 膀胱平滑肌細(xì)胞
大鼠 膀胱基質(zhì)成纖維細(xì)胞
大鼠 前列腺上皮細(xì)胞
大鼠 前列腺成纖維細(xì)胞
大鼠 腎周細(xì)胞
大鼠 甲狀腺上皮細(xì)胞
大鼠 甲狀腺成纖維細(xì)胞
大鼠 胰腺星狀細(xì)胞
大鼠 胰島細(xì)胞
大鼠 垂體細(xì)胞
大鼠 胸腺細(xì)胞
大鼠 胸腺基質(zhì)細(xì)胞
大鼠 頜下腺上皮細(xì)胞
大鼠 腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞
大鼠 腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞
大鼠 精原細(xì)胞
大鼠 睪丸支持細(xì)胞
大鼠 海綿體平滑肌細(xì)胞
大鼠 卵巢顆粒細(xì)胞
大鼠 卵巢間質(zhì)細(xì)胞
大鼠 輸卵管上皮細(xì)胞
大鼠 輸卵管平滑肌細(xì)胞
大鼠 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞
大鼠 子宮內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞
大鼠 卵巢表面上皮細(xì)胞
大鼠 乳腺上皮細(xì)胞
大鼠 乳腺成纖維細(xì)胞
大鼠 卵巢內(nèi)膜細(xì)胞
大鼠 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞
大鼠 睪丸間質(zhì)細(xì)胞
大鼠 子宮成纖維細(xì)胞
大鼠 骨細(xì)胞
大鼠 成骨細(xì)胞
大鼠 軟骨細(xì)胞
大鼠 滑膜成纖維細(xì)胞
大鼠 骨骼肌細(xì)胞
大鼠 骨骼肌成纖維細(xì)胞
大鼠 纖維環(huán)細(xì)胞
大鼠 髓核細(xì)胞
大鼠 破骨細(xì)胞
大鼠 皮膚成纖維細(xì)胞
大鼠 角質(zhì)形成細(xì)胞
大鼠 表皮干細(xì)胞
大鼠 前脂肪細(xì)胞
大鼠 脂肪微血管內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 真皮毛乳頭細(xì)胞
大鼠 外根鞘細(xì)胞
大鼠 毛囊角質(zhì)細(xì)胞
大鼠 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
大鼠 脂肪干細(xì)胞
大鼠 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞
大鼠 B淋巴細(xì)胞
大鼠 T淋巴細(xì)胞
大鼠 單核細(xì)胞
大鼠 DC細(xì)胞
大鼠 NK細(xì)胞
大鼠 內(nèi)皮祖細(xì)胞
大鼠 胸腺上皮細(xì)胞
大鼠 胸腺成纖維細(xì)胞
大鼠 脾基質(zhì)細(xì)胞
大鼠 脾源性內(nèi)皮祖細(xì)胞
大鼠 淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 淋巴管成纖維細(xì)胞
大鼠 骨髓肥大細(xì)胞
大鼠 骨髓單核細(xì)胞
大鼠 脾淋巴細(xì)胞
大鼠 骨髓巨噬細(xì)胞
大鼠 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 腦動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 腦血管周細(xì)胞
大鼠 腦膜細(xì)胞
大鼠 腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞
大鼠 海馬神經(jīng)元細(xì)胞
大鼠 脊髓神經(jīng)元細(xì)胞
大鼠 雪旺細(xì)胞
大鼠 星形膠質(zhì)細(xì)胞
大鼠 小膠質(zhì)細(xì)胞
大鼠 少突膠質(zhì)細(xì)胞
大鼠 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞
大鼠 腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
大鼠 神經(jīng)干細(xì)胞
大鼠 腦血管成纖維細(xì)胞
大鼠 DRG神經(jīng)元細(xì)胞
大鼠 下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞
大鼠 角膜上皮細(xì)胞
大鼠 角膜基質(zhì)細(xì)胞
大鼠 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞
大鼠 晶狀體上皮細(xì)胞
大鼠 結(jié)膜成纖維細(xì)胞
大鼠 結(jié)膜上皮細(xì)胞
大鼠 脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 脈絡(luò)膜成纖維細(xì)胞
大鼠 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 牙周膜成纖維細(xì)胞
大鼠 牙周膜干細(xì)胞
大鼠 牙髓干細(xì)胞
大鼠 口腔黏膜上皮細(xì)胞
大鼠 舌表皮細(xì)胞
大鼠 鼓膜上皮干細(xì)胞
大鼠 角膜內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠 鞏膜上皮細(xì)胞
大鼠 視網(wǎng)膜mulller細(xì)胞
大鼠 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞
大鼠 胚胎成纖維細(xì)胞
雞胚胎成纖維細(xì)胞
三.污染防治
1.細(xì)菌污染
細(xì)菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的污染,主要由操作不慎或使用了滅菌不*的耗材與試劑引入。最常見的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態(tài)則為長桿狀、短桿狀和顆粒狀等。
好氧菌增殖分裂迅速,感染24h內(nèi)即可使培養(yǎng)基渾濁;厭氧菌在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下增殖緩慢,需要較長時(shí)間才會(huì)觀察到渾濁現(xiàn)象。
污染處理:由于國內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)中抗生素使用泛濫,所以出現(xiàn)污染后加雙抗(青霉素&鏈霉素,Penicillin + Streptomycin)一般沒有效果。桿菌可選用100ug/ml慶大霉素處理一周,顆粒狀細(xì)菌可用25ug/ml環(huán)丙沙星處理一周,效果相對(duì)還不錯(cuò)。
2. 真菌污染
細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的污染真菌有:煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。
左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片,右圖是酵母污染,鏡下可以看到明顯的出芽形態(tài)。
污染處理:可用100ug兩性霉素/T25瓶,處理一周。
注:性較大,需要在細(xì)胞有50%以上且狀態(tài)沒受大影響前處理。