細胞名稱:牛腎細胞
MDBK
培養條件:1640+10%FBS+1%P/S
生長狀態:貼壁生長
細胞是生物學實驗的重要材料,也是生物細胞學實驗的基礎,藥物、基因功能、疾病機理等的相關研究多數需要在細胞水平進行闡釋。而細胞培養,受人員操作和環境條件的影響比較大,在細胞培養中常常會遇到很多的細節問題,而每個問題都有可能導致細胞培養的失敗。我們匯總了細胞實驗室多年來的細胞培養經驗分享給大家,希望能給大家的細胞培養帶來幫助。
一.細胞系身份需明確
我們之所以選定某種細胞系開展實驗,是因為所選細胞系的一些特性符合研究方向的設定。比如組織特性,疾病特性,功能特性,基因表達特性等。一旦用錯了細胞株,對我們研究結果的判斷就會帶來很大的誤差和不確定性。
而近年來,多個機構發現細胞系在培養和流通過程中,出現了很嚴重的交叉污染。據不*統計,單就HeLa細胞系導致的污染致使3萬多篇論文結果的準確性存在問題(doi:10.1371/journal.pone.0186281)。而這種情況不僅僅限于HeLa細胞。多個機構研究人員檢測發現超過451個細胞系已被其它細胞*吸收,在所檢測細胞中污染占比46%,可見細胞交叉污染的現象非常普遍。因此,做實驗前對細胞株驗明正身非常重要。如果是在機構購買的細胞株,最好能讓供方提供合格的STR鑒定報告。
目前,STR基因分型方法是進行細胞交叉污染和性質鑒定的*和準確的方法之一,是ATCC等機構認定的金標準。不過可惜的是并非所有細胞均可進行STR鑒定,目前只有大部分的人源細胞株和45個種類的小鼠細胞株可以進行鑒定。其他細胞株可以結合細胞形態、特性和物種鑒定來進行確認。
二.培養、傳代、凍存和復蘇
1.準備工作:
根據培養細胞的特性,提前準備好適合的培養基和血清等。最好沿用細胞原來的培養條件,以免細胞在新環境下還需要過渡適應。同時,充分了解到細胞的生長特性和形態特征,便于后續的培養觀察。
2.貼壁細胞傳代:
1)移棄使用過的細胞培養液。(不要直接倒掉,避免瓶口殘留導致易污染)
2)使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液(PBS)沖洗細胞。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液,以避免攪動細胞層,前后搖晃容器數次,最后移棄沖洗液。(洗去殘留的血清,避免影響胰酶的活性。)
3)以 25 cm2的培養瓶為例,向瓶內加入1ml胰蛋白酶-EDTA(請根據各細胞的指引使用合適的濃度)消化液,輕輕搖動培養瓶,使消化液流遍所有細胞表面,放到37 ℃ 孵育。通常,幾分鐘內,會發現胞質回縮、細胞間隙增大,傾斜培養瓶時細胞層能自然流下,此時應加入2-3ml含血清的*培養液終止消化(細胞解離所需時間請參考各細胞的指引,并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細胞的解離情況)。另外,并不是所有貼壁細胞都適用采用胰蛋白酶進行解離,請根據各細胞的指引選擇合適的解離方法。
4)使培養瓶傾斜,吸取培養瓶內液體輕輕沖向原細胞生長表面,重復該動作2-3次,使所有細胞沿瓶底流下,再輕柔地把細胞吹打成單個懸液(吹打過程中應避免氣泡的產生)。
PS:對于難消化的細胞,盡量不要通過用力吹打的方式來處理,以免對細胞產生物理損傷。可以先將已經消化的細胞分出來,及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細胞進行再次消化。做到分層消化,避免易消化細胞長時間在胰酶消化下受損。
5)把所有的細胞懸液轉移到15ml離心管中,800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。
6)加入新的含血清*培養液重懸成單細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例,把細胞懸液均勻分到各培養器皿中,補足新的含血清*培養液,輕輕搖晃混勻。
7)放到37 ℃ 孵育,第二天顯微鏡下觀察細胞的貼壁情況。
3.懸浮細胞傳代:
因懸浮生長細胞不貼壁,故傳代時不必采用酶消化方法,而可直接傳代或離心收集細胞后傳代。
1)直接傳代時,靜置5-10分鐘,待懸浮細胞慢慢沉淀到器皿底部后,吸掉1/2-2/3原培養液,補足新鮮的含血清*培養液,混勻成細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例,把細胞懸液均勻分到各培養器皿中,輕輕搖晃混勻。
2)離心傳代時,將細胞連同培養液一并轉移到離心管內,800-1000rpm離心3-5分鐘,移棄上清后,加入新鮮的含血清*培養液重懸。按各細胞指引推薦的傳代比例,把細胞懸液均勻分到各培養器皿中,補足新鮮的含血清*培養液,輕輕搖晃混勻。
3)放到37 ℃ 孵育,第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。
4.貼壁懸浮混合型細胞傳代:
先將懸浮的細胞收集,再參考“貼壁細胞傳代"方法進行消化收集,一起接種到培養器皿中。
PS: 懸浮細胞生長中一般對細胞密度要求比較高,培養中最好參考指南控制好細胞密度,不能過密也不能過稀。
5.細胞凍存:
1)按照“細胞傳代步驟"中的方法收集細胞。
2)加入細胞凍存液(一般10%DMSO+對應細胞的*培養液),使細胞的終密度為(5~10)×105個/ml,移入細胞凍存管中。
3)程序降溫(以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例):4℃ 30min→-80℃過夜→液氮。(一定不能省略4℃的30min,否則凍存液無法滲透到細胞,易產生冰晶導致細胞受損。)
6.細胞復蘇:
1)取出貯存的細胞,待液氮揮發后,馬上37℃水浴中輕輕搖動使快速融化(通常2min內,時間長了細胞狀態會受影響)。為避免劇烈的溫差變化導致凍存管炸裂,操作該步時請配戴防護面罩或防護目鏡。
PS:干冰運輸的凍存細胞,收到后需要立刻放入深低溫冰箱或液氮中,至少3d后再進行復蘇操作。
2)轉移到無菌操作臺,75%酒精擦拭凍存管外部。
3)將細胞懸液轉移到裝有10-20ml經預熱的含血清*培養液離心管中,800-1000rpm離心3-5分鐘,移棄上清。
4)重新加入經預熱的含血清*培養液重懸細胞,以約(3~5)×105個/ml密度接種到培養器皿中。
5)放到37℃孵育,第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。
大鼠 肺微血管內皮細胞
大鼠 肺動脈內皮細胞
大鼠 肺動脈平滑肌細胞
大鼠 肺動脈外膜成纖維細胞
大鼠 II型肺泡上皮細胞
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大鼠 氣管平滑肌細胞
大鼠 支氣管上皮細胞
大鼠 支氣管平滑肌細胞
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大鼠 肺微血管周細胞
大鼠 心肌細胞
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大鼠 主動脈內皮細胞
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大鼠 主動脈外膜成纖維細胞
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大鼠 頸動脈內皮細胞
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大鼠 胃粘膜上皮細胞
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大鼠 小腸黏膜上皮細胞
大鼠 小腸平滑肌細胞
大鼠 小腸隱窩上皮細胞
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大鼠 膽囊上皮細胞
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大鼠 肝外膽管上皮細胞
大鼠 肝實質細胞
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大鼠 肝Kupffer細胞
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大鼠 肝成纖維細胞
大鼠 腸間質細胞
大鼠 腎小管上皮細胞
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大鼠 腎小球內皮細胞
大鼠 腎足細胞
大鼠 輸尿管上皮細胞
大鼠 輸尿管平滑肌細胞
大鼠 膀胱上皮細胞
大鼠 膀胱平滑肌細胞
大鼠 膀胱基質成纖維細胞
大鼠 前列腺上皮細胞
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大鼠 腎周細胞
大鼠 甲狀腺上皮細胞
大鼠 甲狀腺成纖維細胞
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大鼠 胸腺細胞
大鼠 胸腺基質細胞
大鼠 頜下腺上皮細胞
大鼠 腎上腺皮質細胞
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大鼠 海綿體平滑肌細胞
大鼠 卵巢顆粒細胞
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大鼠 輸卵管上皮細胞
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大鼠 子宮內膜平滑肌細胞
大鼠 卵巢表面上皮細胞
大鼠 乳腺上皮細胞
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大鼠 卵巢內膜細胞
大鼠 子宮內膜間質細胞
大鼠 睪丸間質細胞
大鼠 子宮成纖維細胞
大鼠 骨細胞
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大鼠 皮膚成纖維細胞
大鼠 角質形成細胞
大鼠 表皮干細胞
大鼠 前脂肪細胞
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大鼠 外根鞘細胞
大鼠 毛囊角質細胞
大鼠 骨髓間充質干細胞
大鼠 脂肪干細胞
大鼠 滑膜間充質干細胞
大鼠 B淋巴細胞
大鼠 T淋巴細胞
大鼠 單核細胞
大鼠 DC細胞
大鼠 NK細胞
大鼠 內皮祖細胞
大鼠 胸腺上皮細胞
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大鼠 脾基質細胞
大鼠 脾源性內皮祖細胞
大鼠 淋巴管內皮細胞
大鼠 淋巴管成纖維細胞
大鼠 骨髓肥大細胞
大鼠 骨髓單核細胞
大鼠 脾淋巴細胞
大鼠 骨髓巨噬細胞
大鼠 腦微血管內皮細胞
大鼠 腦動脈血管內皮細胞
大鼠 腦血管周細胞
大鼠 腦膜細胞
大鼠 腦皮層神經元細胞
大鼠 海馬神經元細胞
大鼠 脊髓神經元細胞
大鼠 雪旺細胞
大鼠 星形膠質細胞
大鼠 小膠質細胞
大鼠 少突膠質細胞
大鼠 神經膠質細胞
大鼠 腦動脈平滑肌細胞
大鼠 神經干細胞
大鼠 腦血管成纖維細胞
大鼠 DRG神經元細胞
大鼠 下丘腦神經元細胞
大鼠 角膜上皮細胞
大鼠 角膜基質細胞
大鼠 視網膜色素上皮細胞
大鼠 晶狀體上皮細胞
大鼠 結膜成纖維細胞
大鼠 結膜上皮細胞
大鼠 脈絡膜微血管內皮細胞
大鼠 脈絡膜成纖維細胞
大鼠 視網膜微血管內皮細胞
大鼠 牙周膜成纖維細胞
大鼠 牙周膜干細胞
大鼠 牙髓干細胞
大鼠 口腔黏膜上皮細胞
大鼠 舌表皮細胞
大鼠 鼓膜上皮干細胞
大鼠 角膜內皮細胞
大鼠 鞏膜上皮細胞
大鼠 視網膜mulller細胞
大鼠 胎盤間充質干細胞
大鼠 胚胎成纖維細胞
牛腎細胞
三.污染防治
1.細菌污染
細菌污染是細胞培養中最常見的污染,主要由操作不慎或使用了滅菌不*的耗材與試劑引入。最常見的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態則為長桿狀、短桿狀和顆粒狀等。
好氧菌增殖分裂迅速,感染24h內即可使培養基渾濁;厭氧菌在常規細胞培養條件下增殖緩慢,需要較長時間才會觀察到渾濁現象。
污染處理:由于國內細胞培養中抗生素使用泛濫,所以出現污染后加雙抗(青霉素&鏈霉素,Penicillin + Streptomycin)一般沒有效果。桿菌可選用100ug/ml慶大霉素處理一周,顆粒狀細菌可用25ug/ml環丙沙星處理一周,效果相對還不錯。
2. 真菌污染
細胞培養中最常見的污染真菌有:煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。
左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片,右圖是酵母污染,鏡下可以看到明顯的出芽形態。
污染處理:可用100ug兩性霉素/T25瓶,處理一周。
注:性較大,需要在細胞有50%以上且狀態沒受大影響前處理。