倉(cāng)鼠腎成纖維細(xì)胞BHK-21細(xì)胞
培養(yǎng)條件:MEM+10%FBS+1%P/S
生長(zhǎng)狀態(tài):貼壁生長(zhǎng)
細(xì)胞培養(yǎng)的原理和步驟,簡(jiǎn)單好用以及精確!
今天我們要講解的是,細(xì)胞培養(yǎng)的原理和步驟,簡(jiǎn)單好用以及精確,學(xué)完之后,相信你對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將不再陌生。接下來(lái)就開(kāi)始今天的學(xué)習(xí)吧!
細(xì)胞培養(yǎng):體外模擬體內(nèi)需要的生長(zhǎng)條件(溫度,營(yíng)養(yǎng)等),然后加上一些處理?xiàng)l件,比如做藥物篩選,就可以做抗性基因的表達(dá)的篩選,比如還可以測(cè)定某個(gè)基因敲低或是過(guò)表達(dá)的產(chǎn)物,這個(gè)當(dāng)然要結(jié)合WB來(lái)看最后基因的表達(dá)產(chǎn)物是否升高哦,細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用還有很多。
細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理:細(xì)胞傳代(生存空間和營(yíng)養(yǎng)不足,長(zhǎng)得太密,代謝廢物太多,要洗洗,同時(shí)也要分離出一部分細(xì)胞,要加入新的培養(yǎng)液),換液(生存空間和營(yíng)養(yǎng)剩余,但是代謝廢物太多,要洗洗,要吃飯,才能長(zhǎng)好,所以要洗和加入新鮮培養(yǎng)基),凍存(太多了,先存起來(lái),液氮里面里就是低溫,保存能量,活得久),復(fù)蘇(解凍,恢復(fù)吃飯的能力,恢復(fù)生長(zhǎng)。)這四步。
細(xì)胞培養(yǎng)的基本步驟(一定要明白每個(gè)步驟的意義和目的):
01細(xì)胞傳代(貼壁細(xì)胞):
試劑:PBS,胰酶,含血清的培養(yǎng)基;
流程:顯微鏡下看一看培養(yǎng)皿里的細(xì)胞多不多,太多(80%~90%)會(huì)導(dǎo)致代謝廢物很多,先吸掉廢液,再用PBS洗一洗,同時(shí)太多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞黏在一起,這時(shí)候就需要加點(diǎn)胰酶消除它們之間的粘性,是否消除完,在顯微鏡下看一看,看完加入適宜的含血清的培養(yǎng)基,中和一下胰酶,這叫吹打,除此之外,細(xì)胞太多了,把一部分細(xì)胞移出來(lái),加入適量的培養(yǎng)基放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng),這叫傳代。
02細(xì)胞換液:
試劑:PBS,含血清的培養(yǎng)基;
流程:先吸掉代謝廢物(即細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)液),再用PBS洗一洗,由于細(xì)胞長(zhǎng)得不是很多,細(xì)胞之間沒(méi)有黏在一起,因此不需要加入胰酶來(lái)消除它們之間的粘性。由于細(xì)胞要吃飯,加入新鮮的含血清的培養(yǎng)基,最后放到孵箱里面進(jìn)行培養(yǎng)。
03細(xì)胞凍存:
試劑:凍存液,PBS,胰酶,含血清的培養(yǎng)基;
流程:要凍存,先配置凍存液,凍存液包含了:DMSO:防止在低溫(零度以下至-196℃)保存細(xì)胞時(shí),細(xì)胞內(nèi)液會(huì)形成冰晶,滲透壓會(huì)發(fā)生改變,細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)紊亂,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)損傷。凍存液制備時(shí),一般需與血清一起配置:因?yàn)閮烧呋ト跁r(shí),會(huì)散發(fā)熱量,所以?xún)龃嬉盒杼崆爸苽洹?/span>
因?yàn)榧?xì)胞太多了,需要凍存,所以要先看一看,吸一吸,洗一洗,分一分,中和一下,吹打制成細(xì)胞懸液,離心,吸掉上清液,加入凍存液,輕輕吹吸均勻,每管等量1ml裝入凍存管,4℃20min,-20℃30min,-80℃過(guò)夜,最后放入液氮罐。
04細(xì)胞復(fù)蘇:
試劑:含血清的培養(yǎng)基;
流程:從液氮中取出凍存管,迅速(小于3min)置于37℃水浴鍋中,解凍時(shí),邊晃動(dòng)邊觀(guān)察,當(dāng)看到只有一小塊冰存在時(shí),即可從水浴鍋中取出,打開(kāi)凍存管,迅速將細(xì)胞懸液吸到離心管中,輕輕混勻,1000r/min,離心五分鐘,吸掉上清液,沉淀中加入適量培養(yǎng)液,放入孵箱中,培養(yǎng)。還有就是:復(fù)蘇的細(xì)胞,需要在24小時(shí)后,換一次培養(yǎng)液。
最后:在這里特別感謝B站上無(wú)私分享的細(xì)胞培養(yǎng)的視頻資源,正是你們的分享,幫助了我,我也會(huì)繼續(xù)把我學(xué)到的繼續(xù)分享,幫助更多的人!如果大家想要獲得這份視頻資源的話(huà),可以在后臺(tái)私聊小編獲取哦,里面關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的知識(shí)講解的超級(jí)詳細(xì)!明天我會(huì)繼續(xù)介紹細(xì)胞培養(yǎng)的一些注意事項(xiàng)以及WB的操作的步驟和原理。
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隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展和普及,細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等多種學(xué)科研究的重要工具。然而,要進(jìn)行一次成功的細(xì)胞培養(yǎng)并不是件輕松簡(jiǎn)單的事情。
要想在一次細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中獲得足量且優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)物,通常要做到以下幾點(diǎn):活力好且無(wú)污染的種子細(xì)胞;適合該細(xì)胞生長(zhǎng)的*培養(yǎng)基;安全無(wú)污染的試劑耗材;嚴(yán)格的無(wú)菌操作;完備的細(xì)胞培養(yǎng)知識(shí)體系。在這幾點(diǎn)當(dāng)中,有些小的細(xì)節(jié)往往容易被忽視,快來(lái)看看你是否中過(guò)招吧!
1.及時(shí)保種—未雨綢繆,有備無(wú)患:就算是細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)再豐富,細(xì)胞房條件再好,也無(wú)法100%避免微生物污染。一旦培養(yǎng)物發(fā)生污染,將會(huì)很難補(bǔ)救。所以,在拿到種子細(xì)胞后,及時(shí)“備份"不失為一種明智之舉。具體做法是:如果拿到的是一瓶密度合適的活細(xì)胞(以T25培養(yǎng)瓶為例)--第一次傳代時(shí),一半細(xì)胞直接凍存一支保種,剩下一半細(xì)胞接種至一個(gè)(或多個(gè),比例視細(xì)胞增殖速度、細(xì)胞類(lèi)型而定)新的培養(yǎng)瓶;如果拿到的是凍存管--先復(fù)蘇至一個(gè)培養(yǎng)瓶,待細(xì)胞長(zhǎng)到傳代密度后,按上面活細(xì)胞處理方法保種。這樣一來(lái),可以大大減少培養(yǎng)物還未大量擴(kuò)增就被污染或狀態(tài)差導(dǎo)致無(wú)種子可用的尷尬境地啦!
2.PBS的選用:傳代之前需要用PBS洗去殘留培養(yǎng)基是因?yàn)槠渲械?/span>Ca+、Mg+會(huì)降低胰蛋白酶活性。所以,一定要使用DPBS或者不含Ca+、Mg+的PBS哦!否則可能會(huì)出現(xiàn)消化時(shí)間變長(zhǎng)、消化不*甚至消化不下來(lái)細(xì)胞的情況。
3. 消化時(shí)間的把握:說(shuō)明書(shū)上的消化時(shí)間僅供參考,不要*遵循說(shuō)明書(shū)上的消化時(shí)間,因?yàn)橄瘯r(shí)間和細(xì)胞密度、胰酶效價(jià)甚至細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)。要邊消化邊在顯微鏡下觀(guān)察(期間不要頻繁晃動(dòng)培養(yǎng)瓶),把握最佳的消化時(shí)間是細(xì)胞培養(yǎng)中的重中之重!
4、消化終止液的選用:一般使用2倍胰酶體積的*培養(yǎng)基或者等體積大豆胰蛋白酶抑制劑來(lái)終止胰酶消化作用,但在使用*培養(yǎng)基終止時(shí)要注意必須確認(rèn)該*培養(yǎng)基含有10%FBS。如果該細(xì)胞采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng),要使用等體積大豆胰蛋白酶抑制劑來(lái)終止消化。
5.培養(yǎng)基的小細(xì)節(jié):培養(yǎng)基能否用來(lái)培養(yǎng)你的細(xì)胞的關(guān)注點(diǎn)除了配方是否合適、是否在保質(zhì)期內(nèi)、有無(wú)微生物污染以外,還需關(guān)注培養(yǎng)基PH值--最直觀(guān)的方法是看培養(yǎng)基是否變成紫紅色。如果培養(yǎng)基是紫紅色,說(shuō)明此時(shí)PH偏高,呈堿性。很多細(xì)胞對(duì)PH值較為敏感(如BV-2,THP-1),偏堿可能導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)差甚至凋亡。為了避免出現(xiàn)這種情況,可在接種細(xì)胞前將適量培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)瓶,然后放入CO2培養(yǎng)箱靜置20Min以調(diào)整PH(非透氣瓶要擰松瓶口)。可以這么做的原因是因?yàn)榻^大多數(shù)培養(yǎng)基(L-15培養(yǎng)基除外)都具PH緩沖系統(tǒng)。
6.經(jīng)常鋪不勻細(xì)胞怎么辦:一般使用“十字法"搖勻細(xì)胞,但如果把握不好力度和搖晃次數(shù)的話(huà)很可能無(wú)法鋪勻細(xì)胞,為自己的實(shí)驗(yàn)或下次傳代帶來(lái)不必要的麻煩。解決辦法是:將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶后立起培養(yǎng)瓶輕輕吹打培養(yǎng)基2-3次后立即平放入培養(yǎng)箱,在細(xì)胞貼壁前不再搬動(dòng)培養(yǎng)瓶。