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EBV 轉(zhuǎn)化的絨猴白細(xì)胞B95-8
  • EBV 轉(zhuǎn)化的絨猴白細(xì)胞B95-8
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貨物所在地:江蘇蘇州市

更新時間:2024-10-28 09:49:49

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EBV 轉(zhuǎn)化的絨猴白細(xì)胞B95-8
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1640+10%FBS+1%P/S  

懸浮生長

細(xì)胞死亡及生長異常

1、首先講一下細(xì)胞生長緩慢的原因:

a)更換了血清或者培養(yǎng)基,細(xì)胞需要一段時間適應(yīng)一下;

b)由于細(xì)胞的特殊種類,培養(yǎng)基中缺少某些生長因子;

c)培養(yǎng)基中有少量真菌或者細(xì)菌污染;

d)傳代的時候細(xì)胞密度過低;

e)細(xì)胞狀態(tài)老化;

f)支原體污染。

2、解決上述問題的方法:

a)如果實(shí)驗(yàn)室沒有某種細(xì)胞最適宜的培養(yǎng)基,可以先用原培養(yǎng)條件凍存一些,然后逐漸增加新的培養(yǎng)基比例,25%、50%75%100%,傳代3-5次后,讓細(xì)胞慢慢適應(yīng)。

b)判斷是不是培養(yǎng)基發(fā)生污染,可以先不加抗生素,觀察細(xì)胞狀態(tài)。

c)增加細(xì)胞的接種密度。

d)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞老化的時候,及時更換新的細(xì)胞。

e)如果懷疑是支原體污染,一定要隔離疑似污染的培養(yǎng)皿,及時清潔消毒孵箱。

3、造成細(xì)胞死亡的原因:

a)細(xì)胞消化過度;

b)沒有及時換液,營養(yǎng)成分消耗殆盡;

c)如果前一天細(xì)胞的狀態(tài)很好,換液之后就全死了,應(yīng)該考慮是否是培養(yǎng)基或者血清的問題。

4、如何判定細(xì)胞是否發(fā)生支原體污染:可以選用直接培養(yǎng)法、熒光染色或PCR方法檢測,比較常用的是PCR。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生支原體污染時,原則上是能夠去除支原體的,但是整個過程耗時耗力,還要考驗(yàn)個人操作能力。所以如果不是處于細(xì)胞存量很少的情況下,建議發(fā)現(xiàn)污染時立刻棄掉,重新培養(yǎng)。

5、如果孵箱中只是某種細(xì)胞持續(xù)性大量死亡,而其他細(xì)胞狀態(tài)都沒問題的話,基本上可以確定就是孵箱存在特異性感染這類細(xì)胞的真菌或細(xì)菌,遇到這種情況,小六兒也不知道該怎么做,只能是先停一段時間看看。。。。。。

5、其他注意事項(xiàng):每個星期都要更換孵箱底盤中的水(紫外照射后超純水);每兩周消毒一次孵箱:75%酒精擦拭一遍后,再用0.1%新潔爾滅擦拭一遍(都用超純水配制);可以在孵箱底部放一個燒杯,里面放入飽和硫酸銅,可以抑制霉菌生長。不過也有人說硫酸銅會改變孵箱的PH值,如果不是孵箱污染的情況很嚴(yán)重,建議不要使用。

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細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇和凍存講究“慢凍快溶",復(fù)蘇時一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細(xì)胞凍存液快速融化至37℃,使胞外凍存時的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶,對細(xì)胞造成損害。

復(fù)蘇準(zhǔn)備

?打開水浴鍋加熱至37℃。

? 超凈臺上放好離心管(一般15ml的),細(xì)胞培養(yǎng)瓶,移液管,紫外滅菌至少2030分鐘,吹風(fēng)510分鐘除去臭氧。

?37℃預(yù)熱好要復(fù)蘇細(xì)胞的培養(yǎng)液,也可以不用預(yù)熱培養(yǎng)液,根據(jù)細(xì)胞情況選擇。

?向離心管中加約510ml培養(yǎng)液,從液氮罐或-80℃中取出凍存細(xì)胞,立即將凍存管放入37℃水浴中并輕輕搖動,待融化后(約2min即可)立即將解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)液的離心管中,800-1000rpm下離心5min,棄上清,加適量*培養(yǎng)液輕輕吹打重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,輕晃使瓶底液體分散均勻,標(biāo)好細(xì)胞名稱、代數(shù)、復(fù)蘇日期,顯微鏡下觀察后放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中。一般貼壁細(xì)胞過夜即可貼壁,換液和傳代時間根據(jù)不同細(xì)胞生長情況而定。

細(xì)胞復(fù)蘇注意事項(xiàng)

?復(fù)蘇時動作要快,盡量減少胞內(nèi)形成冰晶,影響復(fù)蘇后細(xì)胞活率。

? 融化時盡量不要碰到管口,以免容易造成污染。

?若一次性需要復(fù)蘇細(xì)胞很多,可以分批水浴解凍,防止傳熱不佳使得細(xì)胞融化時間延長。

?若需要同時復(fù)蘇好幾種細(xì)胞,提前在離心管和培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記,或記住自己擺放的位置,不要弄混亂。



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