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iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術(shù)是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。iTRAQ技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時比較最多10種樣品之間的蛋白表達量，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。

原理簡介

iTRAQ技術(shù)采用4種或8種同位素編碼的標(biāo)簽，通過對氨基酸N端和賴氨酸殘基進行酶解后用iTRAQ試劑進行特異性標(biāo)記，而后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量。

iTRAQ試劑包括3個部分：報告基團（Report group）、平衡基團（Balance group）和肽反應(yīng)基團（Amine-specific reactive group）。報告基團相對分子質(zhì)量為113-121Da（無120），因此iTRAQ試劑可同時標(biāo)記8組樣品。平衡基團相對分子質(zhì)量為192-184Da（無185），使得八種iTRAQ試劑分子量均為305Da，保證標(biāo)記的同一肽段質(zhì)荷比（m/z）相同。肽反應(yīng)基團將iTRAQ試劑與肽段的N端及賴氨酸的氨基特異結(jié)合，在其上報告基團通過平衡基團與反應(yīng)基團相連，形成等量異位標(biāo)簽。

在串聯(lián)質(zhì)譜中，來自不同樣品的同一肽段由于是等質(zhì)量的，在一級質(zhì)譜檢測（MS1）中表現(xiàn)為一個母離子峰（即同一個質(zhì)譜峰），在二級質(zhì)譜檢測（MS2）中進一步碎裂時，報告基團、質(zhì)量平衡基團和多肽反應(yīng)基團之間的鍵斷裂，質(zhì)量平衡基團丟失，報告基團則會產(chǎn)生相應(yīng)的不同質(zhì)量數(shù)的報告離子，它們各自質(zhì)譜峰的信號強弱，代表著來源于不同樣品的該肽段及其所對應(yīng)的蛋白的表達量的高低。因此，根據(jù)報告離子的信號強度值即可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經(jīng)過軟件處理得到蛋白質(zhì)的定量信息。同時，多肽內(nèi)的酰胺鍵斷裂，形成一系列b離子和y離子，得到離子片段的質(zhì)量數(shù)，通過數(shù)據(jù)庫查詢和比較，可以鑒定出相應(yīng)的蛋白質(zhì)前體。

實驗流程

蛋白提取和質(zhì)控——iTRAQ標(biāo)記肽段——HPLC分級——質(zhì)譜分析——數(shù)據(jù)庫處理——生物信息學(xué)分析

圖1 iTRAQ實驗流程圖。

TMT（Tandem Mass Tag）技術(shù)是由美國Thermo Scientific公司研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。與iTRAQ技術(shù)原理相同，優(yōu)勢類似，但是比iTRAQ擁有更多的標(biāo)簽數(shù)，能一次上機更多樣品。

原理簡介

TMT技術(shù)采用2種、6種、10種或16種同位素標(biāo)簽，特異性標(biāo)記多肽的氨基基團，然后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，監(jiān)測碎裂下來的標(biāo)簽實現(xiàn)肽段定量。一次實驗可同時比較最多16組不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量。

TMT標(biāo)簽由三部分組成：分子量報告子（報告基團）、分子量標(biāo)準化部分（平衡基團）和（肽）反應(yīng)基團，形成2種、6種、10種或16種相對分子質(zhì)量均為等量的異位標(biāo)簽。TMT試劑通過反應(yīng)基團與肽段上賴氨酸及N端氨基酸殘基相連，能夠高效地標(biāo)記酶解后的肽段。在一級質(zhì)譜中，分子量標(biāo)準化部分使任何一種TMT試劑標(biāo)記的不同樣本中的同一肽段表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在二級質(zhì)譜中，釋放出分子量報告子。每個報告子都有各自du特的分子量，產(chǎn)生不同的報告離子峰，其強度反應(yīng)了該肽段在不同樣品中的相對表達量信息，另外二級質(zhì)譜中的肽段碎片離子峰質(zhì)荷比反應(yīng)了該肽段的序列信息，根據(jù)這些質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)可得到蛋白質(zhì)的定性和相對定量信息。

實驗流程

蛋白提取和質(zhì)控——TMT標(biāo)記肽段——HPLC分級——質(zhì)譜分析——數(shù)據(jù)庫處理——生物信息學(xué)分析

SILAC即細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)。SILAC是一種通過使用13C-葡萄糖、15NH或3C標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基引入穩(wěn)定同位素，標(biāo)記細胞或小生物體內(nèi)的蛋白并根據(jù)質(zhì)譜豐度比率進行定量的體內(nèi)代謝標(biāo)記技術(shù)。

最初SILAC使用的標(biāo)記氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸，目前常用的標(biāo)記氨基酸有亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等。

原理簡介

在細胞培養(yǎng)基中加入天然同位素（輕型）或穩(wěn)定同位素（重型）標(biāo)記的必需氨基酸，替代細胞培養(yǎng)基中相應(yīng)的氨基酸，細胞經(jīng)若干傳代后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸wan全摻入到細胞新合成的蛋白質(zhì)中，取代了原有的氨基酸。這樣，兩個蛋白之間就存在分子量的改變，而其它化學(xué)性質(zhì)無異。然后將兩組細胞混合，提取蛋白質(zhì)，經(jīng)分離純化后進行質(zhì)譜測定。

每個肽段作為質(zhì)譜中的一對：低分子量的肽段含有輕型氨基酸，來源于A組，高分子量的肽段則含有重型氨基酸，來源于B組。如果SILAC肽段對呈現(xiàn)1：1的比例，則蛋白質(zhì)組中此蛋白的豐度無差異。如果含有重型氨基酸的肽段峰強度偏高，則說明B組中蛋白豐度更高。因為穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸與天然氨基酸的化學(xué)性質(zhì)基本相同，除了分子量有差異。因此，質(zhì)譜上峰強度的比值直接對應(yīng)了A組與B組的比例，即可對蛋白質(zhì)進行相對定量。

實驗流程

細胞培養(yǎng)標(biāo)記——蛋白提純——1:1混合蛋白樣品——蛋白還原、酶切——LC-MS液質(zhì)串聯(lián)檢測——生物信息學(xué)分析

圖2 SILAC實驗流程圖。

蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)（Label-free）是經(jīng)典的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。該技術(shù)無需昂貴的同位素（iTRAQ和TMT）標(biāo)簽做內(nèi)標(biāo)，而是通過比較質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強度，分析不同來源樣品蛋白的數(shù)量變化。該方法認為肽段在質(zhì)譜中被捕獲檢測的頻率與其在混合物中的豐度成正相關(guān)，因此蛋白質(zhì)被質(zhì)譜檢測的計數(shù)反映了蛋白質(zhì)的豐度，通過適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)公式可以將質(zhì)譜檢測計數(shù)與蛋白質(zhì)的量聯(lián)系起來，從而對蛋白質(zhì)進行定量。

原理簡介

Label-free通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對蛋白質(zhì)酶解肽段進行質(zhì)譜分析，按照其原理主要分為兩種，di一種Spectrum counts類的非標(biāo)記方法，發(fā)展比較早，已經(jīng)形成多種定量算法。其主要的原理是以MS2的鑒定結(jié)果為定量基礎(chǔ)，各種方法的差別在于后期算法在大規(guī)模數(shù)據(jù)上的修正。第二種非標(biāo)記定量的原理是以MS1為基礎(chǔ)，計算每個肽段的信號強度在LC-MS上的積分（如Maxquant），以積分面積對肽段對應(yīng)的蛋白質(zhì)進行相對定量。

實驗流程

蛋白提取——蛋白酶解——高效液相HPLC預(yù)分離——MS質(zhì)譜分離——原始數(shù)據(jù)搜庫分析——生物信息學(xué)分析

圖3 Label-free實驗流程圖。

DIA（Data-independent acquisition）技術(shù)是瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Ruedi Aebersold博士及其團隊與AB-SCIEX公司聯(lián)合研發(fā)的一項全新質(zhì)譜技術(shù)，而SWATH（Sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions）便是基于DIA采集模式的一種新技術(shù)。

DIA采集模式將質(zhì)譜整個全掃描范圍分為若干個小窗口，然后依次對每個窗口中的所有離子進行檢測、碎裂，使其能夠?qū)呙鑵^(qū)間內(nèi)的所有肽段離子進行高速一級MS掃描，再進行二級MS/MS分析，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的信息，在碎片離子層面完整重現(xiàn)nanoLC的色譜峰圖，因此DIA定量可以利用碎片離子隨時間的積分來表征肽段含量，而利用二級碎片離子定量不僅可以降低樣本檢測的缺失值，同時提高定量準確性和重復(fù)性，實現(xiàn)大樣本隊列中高覆蓋率，高穩(wěn)定，高精準的蛋白質(zhì)組定量分析。但本質(zhì)上，DIA也是一種Label-free定量方法。

原理簡介

DIA/SWATH技術(shù)將掃描范圍劃分為以25 Dalton為間隔的一系列區(qū)間，通過超高速掃描來獲得掃描范圍內(nèi)全部離子的所有碎片信息。以蛋白質(zhì)組學(xué)樣品分析中常見的掃描范圍400~1200為例，每25 Dalton作為一個掃描間隔（SWATH），每個SWATH掃描時間設(shè)定為100 ms，那么該掃描范圍累計需要32個SWATH（1200-400/25=32），完成一次掃描僅需要3.2秒。

與傳統(tǒng)的shotgun技術(shù)相比，SWATH技術(shù)能夠?qū)呙鑵^(qū)間內(nèi)所有的肽段母離子經(jīng)過超高速掃描并進行二級碎裂，使用二級碎片離子進行蛋白相對/jue對定量，從而獲得完整的肽段信息。

目前SWATH可以根據(jù)樣品TIC分布進行窗口優(yōu)化，從而獲取更多的譜圖信息，提高了精準度和分辨率。通過高分辨高靈敏質(zhì)譜TripleTOF 5600/+以及zuixin的TripleTOF 6600進行分析掃描。因此，SWATH技術(shù)是一種真正全景式的、高通量的質(zhì)譜技術(shù)，同時也解決了shotgun鑒定重復(fù)度較低的缺點。

實驗流程

蛋白提純——蛋白還原、酶切——HPLC分離肽段——LC-SWATH模式質(zhì)譜檢測——OpenMS分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)——生物信息學(xué)分析

圖4 SWATH實驗流程圖。

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