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肌纖維ATPase染色液(鈣激活法)說明書

時間:2023/3/27閱讀:238
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肌纖維ATPase染色液(鈣激活法)

產(chǎn)品貨號:R23272

 

產(chǎn)品規(guī)格:4×50ml

 

產(chǎn)品簡介:

三磷酸腺苷酶( adenosine triphosphataseATPase)是一種水解酶,是催化ATP分解產(chǎn)生能量的一種酶,根據(jù)所用激活劑、抑制劑以及酶定位的不同分為膜性三磷酸腺苷酶、肌球蛋白三磷酸腺苷酶、線粒體三磷酸腺苷酶等。肌球蛋白三磷酸腺苷酶(myosin ATPase)最適pH9.2~9.4,被鈣離子激活而被鎂離子抑制。它分解ATP時所產(chǎn)生的能量供肌肉收縮之用。此酶定位于骨骼肌,常用來區(qū)分兩型肌纖維。I型肌纖維又稱紅肌,是慢纖維,即肌纖維的收縮較慢而活動持久,其酶活性高,染色深;II型肌纖維又稱白肌,是快纖維,即肌纖維的收縮快,但活動不持久,其酶活性低,染色淡。ATPase水解ATP反應(yīng)如下:

A-P-P-P + H2O→A-P-P + H3PO4 +能量

肌纖維ATPase染色液(鈣激活法)的原理是ATPase水解ATPADP和磷酸,磷酸與鈣離子在酶活性部位結(jié)合形成無色的磷酸鈣沉淀,磷酸鈣經(jīng)氯化鈷處理形成磷酸鈷,再經(jīng)硫化液處理便形成棕黑色的硫化鈷沉淀在酶活性部位。此酶利用酸或堿做前孵育處理,用堿做前孵育處理時,僅白肌纖維出現(xiàn)陽性反應(yīng),這對肌球蛋白ATPase是特異性的;用酸做前孵育處理時,紅肌纖維首先倍染色。因此鈣激活法的ATPase染色主要用來區(qū)分紅肌和白肌,這對神經(jīng)性肌wei縮和肌源性肌wei縮的診斷有一定價值。本產(chǎn)品僅用于科研領(lǐng)域,不宜用于臨床診斷或其他用途。

 

產(chǎn)品組成:

產(chǎn)品組成

4×50ml

保存條件

試劑(A): 酸性孵育液

50ml

4℃

試劑(B): 堿性孵育液

50ml

4℃

試劑(C):

ATPase孵育液

試劑(C1): ATPase孵育液A

25ml

4℃

試劑(C2): ATPase孵育液B

25ml

4℃

試劑(D): ATPase鈷溶液

50ml

4℃ 避光

試劑(E): ATPase硫化溶液

2×1ml

4℃ 避光

 

需自備的儀器和用品:

骨骼肌等組織的冰凍切片、水浴鍋或恒溫箱、蒸餾水、梯度乙醇、中性樹膠、二甲苯或環(huán)保浸蠟脫蠟透明液。

 

操作步驟 (僅供參考)

1. 取新鮮組織,低溫恒冷冰凍切片(用液氮快速冷凍效果更佳),厚度6μm,連續(xù)切片貼于玻片上,分別命名為A片、B片,切片不需要固定。

2. 配制ATPase孵育液:ATPase孵育液AATPase孵育液B等比例混合即可,pH應(yīng)為9.3~9.5,即配即用。

3. 配制ATPase硫化工作液:ATPase硫化溶液用蒸餾水稀釋50~100倍即可,即配即用。

4. 酸性孵育液、堿性孵育液和ATPase孵育液使用前應(yīng)提前37℃孵育10min

5. A片浸入酸性孵育液,37℃孵育5min,水沖洗5s,再浸入堿性孵育液37℃孵育30s,水沖洗5s

6. B片浸入堿性孵育液,37℃孵育15min,水沖洗5s

7. A片和B片浸入ATPase孵育液,37℃孵育30~60min,水沖洗5s

8. ATPase鈷溶液孵育3min,水沖洗5s

9. 切片入硫化工作液,孵育30~60s,水沖洗30s

10. 常規(guī)脫水透明,中性樹膠封固。

 

染色結(jié)果:ATPase主要呈黑色或棕黑色。

肌纖維類型

酸性孵育液

堿性孵育液

I(紅肌)

IIa(白肌)

IIb(白肌)

中度

 

注意事項: 

1. 三磷酸腺苷酶經(jīng)固定后活性大受影響,因此切片不經(jīng)固定。

2. ATPase孵育液經(jīng)混合后pH接近9.4,此時比較適宜酶的染色,如有條件,應(yīng)測定并調(diào)整pH合格后再使用。如果pH偏離很大或出現(xiàn)沉淀都可能導(dǎo)致染色失敗,應(yīng)即配即用。

3. ATPase硫化液有腐蝕性和刺激性氣味,應(yīng)小心操作。每次用過后應(yīng)擰緊蓋子,否則容易揮發(fā)失效。配制硫化工作液時應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。

4. ATPase硫化工作液配后不久自行分解而失效,應(yīng)每次小量配制。

5. 冰凍切片染色時,應(yīng)減少切片在室溫暴露的時間。

6. 染色效果與酸性孵育液、堿性孵育液、ATPase孵育液的pH變化有很大關(guān)系,盡量減少改變pH的因素,如避免反復(fù)開蓋、避免室溫放置過久等。

7. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 

有效期: 6個月有效。4℃運輸,4℃保存。

 


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