4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL)活性檢測試劑盒(紫外分光光度法)產品貨號:BA1005
產品規格:50管/48樣
產品簡介
4-香豆酸:輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)是木質素生物合成的關鍵酶之一,主要催化肉桂酸及其羥基或者甲氧基衍生物生成相應的輔酶A酯,這些中間產物隨后進入苯丙類衍生物支路合成途徑。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中,研究該酶可以探討多種生物細胞發育過程中木質素沉積的代謝機理,為減少水果石細胞含量而提高其品質提供依據。
4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA,其在333nm下測有特征吸收峰,測定4-香豆酸CoA的生成速率,即可反應4CL活性。
產品內容:
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60mL×1瓶 | 4℃ |
試劑一 | 液體30mL×1瓶 | 4℃ |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃ |
試劑三 | 液體6mL×1瓶 | 4℃ |
試劑四 | 粉劑×1瓶 | -20℃ |
試劑五 | 粉劑×1支 | 4℃ |
溶液的配制:
1. 提取液:內含不溶物,使用前搖勻;
2. 試劑二:臨用前加入6mL蒸餾水溶解,可以分裝后-20℃保存,避免反復凍融;
3. 試劑四:臨用前用6mL蒸餾水溶解備用,可以分裝后-20℃保存,避免反復凍融;
4. 試劑五:加入1mL蒸餾水溶解,臨用前用蒸餾水稀釋40倍后備用,現用現配;
5. 工作液的配制:按體積比將試劑二:試劑三:試劑四:試劑五=1:1:1:1的比例配制工作液,現用現配。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟(僅供參考):
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1. 細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
二、測定步驟
1. 紫外分光光度計預熱30min以上,調節波長至333nm,蒸餾水調零。
2. 操作表(在1.5mL EP管中進行下列操作):
試劑名稱(µL) | 測定管 | 空白管 |
樣本 | 100 | - |
蒸餾水 | - | 100 |
工作液 | 400 | 400 |
試劑一 | 500 | 500 |
充分混勻后測定333nm下的初始值A1,37℃反應30min后再次測定吸光值A2,計算ΔA測定管=A2測定管-A1測定管,ΔA空白管= A2空白管-A1空白管,ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管。 |
三、4CL活計算
1. 按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。
4CL(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109 ]÷(V樣×Cpr) ÷T
=15.87×ΔA÷Cpr
2. 按樣本質量計算:
單位定義:每g組織每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。
4CL(U/g質量)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109 ]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T
=15.87×ΔA÷W
3. 按細菌或細胞數量計算:
單位定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。
4CL(U/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109 ]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T
=0.03174×ΔA
V反總:反應體系總體積,1×10-3 L;ε:4-香豆酸輔酶A摩爾消光系數,2.1×104 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,30min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬;109:單位換算系數,1mol=109nmol。
注意事項:
1. 若ΔA大于0.5,將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定。
2. 建議一次測定不要測定過多樣本以免耽誤過多的酶促反應時間。
3. 空白管為檢測各試劑組分質量的檢測孔,正常情況下,變化不超過0.01。
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