Trizol(總RNA提取試劑)
產品貨號:T11180
產品規格:100ml
產品簡介:
Trizol是一種新型的用于細胞或組織的總RNA提取試劑,Trizol采用與Invitrogen TRIzol相似的原理和方法,其顏色、抽提的方法和步驟與后者相同。Trizol含酚和異硫氰酸胍等物質,能迅速裂解細胞或組織并且滅活核酸酶,保持RNA的完整性。加入氯仿并離心后,溶液形成上清層為水相(無色)、中間層、下層為有機相(紅色)。上清層用異丙醇沉淀回收總RNA,中間層用乙醇沉淀回收DNA,下層用異丙醇沉淀回收蛋白。
Trizol適用于從各種組織或細胞中快速分離總RNA,既可用于小量樣品(50~100mg組織、5×106細胞),也可用于大量樣品(>1g組織/>107細胞)。提取的總RNA質量高,可用于Northern blot、Dot blot、polyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆。本產品具有以下特點:①適用范圍廣;②操作簡單,整個過程1小時內完成;③純度高;④污染少。
產品組成:
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
Trizol(總RNA提取試劑) | 100ml | 4℃,避光 |
自備材料:
1. 試劑:無水乙醇、氯仿、異丙醇、DEPC處理水等。
2. 耗材: RNase廣泛存在于人的皮膚上和體液及環境中,RNase是導致RNA降解的最主要物質,非常穩定。操作時應佩戴一次性口罩、手套、帽子。塑料制品、玻璃和金屬物品、實驗儀器等應清除RNase,移液器吸頭、EP管等制品的RNase free處理尤為重要。
3. 儀器:低溫高速離心機、低溫冰箱。
操作步驟 (僅供參考) :
1. 樣品準備
(1)貼壁細胞:
①直接裂解:直接在培養瓶/皿中加入Trizol裂解細胞,每10cm2面積加1ml Trizol,用移液器吹打混勻。
②胰蛋白酶消化:用無菌PBS洗滌細胞后,加入含有0.05~0.25%胰蛋白酶的PBS處理細胞,當細胞脫離容器壁后,加入含有血清的培養基終止反應,將細胞溶液轉移至無RNase的離心管中,5000~6000g離心5min,收集細胞沉淀,去除上清。收集細胞時一定要將細胞培養液去除干凈,否則裂解不,降低RNA收獲率。
(2)懸浮細胞:無需清洗細胞,直接5000~6000 g離心5min,收集細胞。每5×106~107動物、植物和酵母細胞或每107細菌細胞加入1ml Trizol。
(3)組織:取新鮮動物或者植物組織或者-70℃凍存組織,50~100mg組織在液氮中充分研磨或者加入1ml Trizol研磨或者用勻漿器勻漿處理。樣品體積一般不超過Trizol體積的10%。研磨要迅速,以1min為佳。
(4)血液:取0.5~1 ml新鮮或凍存的血液,12000g離心5min,去除血漿,加入1ml Trizol,充分振蕩混勻。
2. 核酸分離:充分振蕩混勻(可以置于低溫/超低溫冰箱凍存5~10min后,充分振蕩,反復1~3次),將裂解樣品或勻漿液室溫放置5~10min,使核蛋白與核酸分離。
3. 樣品分層:加入0.2ml氯仿/1ml Trizol,劇烈振蕩15s,室溫放置2~3min。置于4℃離心機,12000g離心10~15 min。上層為水相,中間層和下層為有機相,RNA在上層水相。
4. 沉淀RNA:吸取上層水相(約500μl)轉移至無RNase的離心管中(不要吸取任何中間層物質,否則會有染色體DNA污染),加入等體積異丙醇混勻(或者加入1.2倍體積Trizol專用RNA沉淀液,超低溫冰箱放置2~3hr,可以大大提高RNA回收率),室溫放置15~20 min。12000 g 4℃離心10min,離心后管側或管底形成膠狀沉淀,棄上清。
5. 洗滌RNA:加入1ml DEPC水配制的75%乙醇/1ml Trizol洗滌沉淀(或者加入1ml Trizol專用RNA洗滌液,可以大大提高RNA純度),室溫放置5~10 min,7500g 4℃離心5min,棄上清。室溫干燥5~10 min,不宜過分干燥,否則RNA難以溶解。
6. 溶解RNA:加入30~50ul RNase-free ddH2O充分溶解RNA,-70℃長期保存或直接用于后續試驗。對于肝、胰腺、腎等組織中RNase含量高的樣品,沉淀時用100%去離子甲酰胺溶解。
分析與定量:
1. 測定樣品在260nm和280nm的吸收值確定RNA的質量。按1OD=40pg RNA計算RNA的產率。OD260/280在1.8~2.0視為抽提RNA純度較好。濃度在4μg/ml以上的樣品適于用分光光度計測定。
2. 進行甲醛變性瓊脂糖電泳,確定RNA的完整性和污染情況。
3. 核酸分析儀測定RNA的質量和純度。
注意事項:
1. 樣品保存:加入Trizol混勻后,樣品可在-70℃放置1~2月;RNA樣品可以在70%酒精中-70℃保存2~4周:如果需要長期保存,應置于超低溫冰箱中保存。
2. Trizol是強腐蝕性物質,污染皮膚或眼睛后,立即用清水或生理鹽水沖洗,必要時尋求醫生的幫助。
3. Trizol可常溫運輸,建議保存4℃保存。
4. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
有效期:12個月有效。
常見問題分析:
常見問題 | 可能原因 |
A260/ A280<1.6 | 抽提得到的RNA沉淀未溶解。 |
水相中混有有機相,從而存在蛋白質和DNA污染。 | |
RNA樣品用水而不是TE溶解。低離子濃度和低pH條件下,A280值會偏高。 | |
樣品勻漿時加的Trizol試劑太少,RNA與蛋白質、DNA未能分離。 | |
勻漿后樣品未在室溫放置或者放置時間太短,RNA與核蛋白未解離。 | |
DNA污染 | 樣品中含組織溶劑(如乙醇等)或堿性溶液,致水相減少或pH升高。 |
樣品勻漿時加入的試劑體積太少。如果存在DNA污染,可用DNA清除劑去除。 | |
水相中混有有機相,從而存在蛋白質和DNA污染。 | |
RNA產量低 | 樣品裂解或勻漿處理不,RNA沒有被釋放出來。 |
得到的RNA沉淀未溶解。 | |
抽提的RNA中含有RNase。 | |
RNA降解 | 組織或細胞不新鮮,樣品沒有及時被液氮凍存,導致組織或細胞中的RNA降解。 |
溶液或離心管未經RNase free處理,RNase的污染導致RNA被降解。 | |
細胞在胰蛋白酶消化時間過長,導致未加Trizol前RNA已經部分降解。 | |
電泳時使用的甲酰胺pH小于3.5,導致RNA發生酸解。 | |
蛋白和多糖污染 | 水相中混有有機相,從而帶有蛋白質和DNA。 |
樣品中蛋白、多糖含量高或樣品量太大,細胞未裂解。 |
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