β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性檢測試劑盒(可見分光光度法)
產品貨號:BA1029
產品規格:50管/24樣
產品內容:
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體50mL×1瓶 | 4℃ |
試劑一 | 粉劑×1瓶 | -20℃ |
試劑二 | 液體15mL×1瓶 | 4℃ |
試劑三 | 液體80mL×1瓶 | 4℃ |
標準品 | 液體1mL×1支 | 4℃ |
溶液的配制:
1. 試劑一:臨用前每瓶加入5mL雙蒸水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。
2. 標準品:5μmol/mL的對硝基苯酚溶液。
產品說明:
β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解,此外還具有轉半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲存的能量,還能在正常的多糖代謝、細胞壁組分代謝以及衰老時細胞壁降解過程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解,釋放自由的半乳糖。
β-GAL分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通過測定吸光值升高速率來計算β-GAL活性。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1. 細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
二、測定步驟:
1. 分光光度計預熱30min以上,調節波長至400nm,蒸餾水調零。
2. 標準液的處理:用蒸餾水將標準液稀釋至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL。
3. 樣本測定(在EP管中依次加入下列試劑):
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 標準管 |
試劑一 | 200 | ||
蒸餾水 | 200 | ||
試劑二 | 250 | 250 | |
樣本 | 50 | 50 | |
迅速混勻,放入 37℃準確水浴30min | |||
標準液 | 500 | ||
試劑三 | 1000 | 1000 | 1000 |
充分混勻,400nm處測定吸光值A,計算ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設一個對照管。 |
三、β-GAL活性計算:
1. 標準曲線的建立:
根據標準管的吸光度(x,減去濃度為0的標準管OD值)和濃度(y,nmol/ml)建立標準曲線, 將△A帶入標準曲線中,計算樣品生成的產物量(nmol/ml)。
2. β-GAL活性計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每小時產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
β-GAL活力(nmol/h /mg prot)=(y×V反總)÷(V樣×Cpr)÷T
=20×y÷Cpr
蛋白濃度需要另外測定。
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每小時產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
β-GAL活力(nmol/h /g鮮重)=(y×V反總)÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=20×y ÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每小時產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
β-GAL活力(nmol/h /104 cell)= (y×V反總)÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.04×y
Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;V反總:反應體系總體積,0.5mL;V樣:加入反應體系中樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500萬;T:反應時間,0.5h。
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