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供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100管/96樣 |
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貨號 | BA1436-100 | 應用領域 | 化工,生物產業 |
產品貨號:BA1436
產品規格:100管/96樣
產品簡介:
乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)是乙醇酸循環中的一種酶,也是植物光呼吸代謝中的關鍵酶,催化乙醇酸氧化生 成乙醛酸,通過測定乙醇酸氧化酶活性,可以了解植物光合和呼吸代謝的基本方法。 乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和鹽酸苯肼反應生成乙醛酸苯腙,在324nm有特征吸收峰。 注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。
產品組成:
產品名稱 | 規格 | 儲存條件 |
提取液 | 液體60mL×2瓶 | 4℃ |
試劑一 | 液體15mL×1瓶 | 4℃ |
試劑二 | 粉劑×2瓶 | -20℃ |
試劑三 | 液體2mL×1瓶 | 4℃ |
溶液的配制:
1. 試劑二:臨用前加入2.5mL雙蒸水溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標儀、低溫離心機、可調式移液槍、微量石英比色皿/96孔板UV板、天平、研缽/勻漿器、 冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g 組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,然后10000g,4℃,離心10min,取上清置冰上待測。
細胞或細菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL 提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
二、測定步驟
1. 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上,調節波長至324nm,紫外分光光度計蒸餾水調零。
2. 將試劑一25℃預熱15min。
3. 樣本測定:在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑:
試劑名稱 | 測定管 | 空白管 |
試劑一(μL) | 130 | 130 |
蒸餾水(μL) | - | 10 |
樣本(μL) | 10 | - |
試劑二(μL) | 40 | 40 |
試劑三(μL) | 20 | 20 |
充分混勻,立即測定324nm處10s和190s吸光值A1和A2,計算ΔA測定管=A2測定-A1測定,ΔA空白管=A2空白-A1空白,ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管。(空白管只需做1-2次) |
GO酶活計算
1. 按微量石英比色皿計算:
(1)按蛋白濃度計算
酶活定義:每毫克蛋白每分鐘生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量為一個酶活力單位。
GO酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反總×109÷(V樣×Cpr)÷T=392.16×ΔA÷Cpr
(2)按樣本質量計算
酶活定義:每克組織每分鐘生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量為一個酶活力單位。
GO 酶活(U/g 質量)=ΔA÷(ε×d)×V反總×109÷(V樣×W÷V樣總)÷T=392.16×ΔA÷W
(3)按細胞數量計算
酶活定義:每萬細胞每分鐘生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量為一個酶活力單位。
GO酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V反總×109÷(V樣×500÷V樣總)÷T=0.784×ΔA
ε:乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數:17000L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應總體積,2×10-4L;V樣:反應中樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL,蛋白濃度自行測定;W:樣本質量,g;T:反應時間,3min;500:500萬個細胞;109:單位換算系數,1mol=109nmol。
2. 按96孔UV板計算:
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm(96孔UV板光徑)進行計算即可。
注意事項:
1. 測定之前進行預實驗,若吸光值A1>1,請將樣本用提取液進行適當的稀釋再測定,并在計算公式中乘以稀釋倍數。
2. 色素含量較高的樣本,可在提取酶時加活性炭吸附。
3. 空白管為檢測各試劑組分質量的檢測孔,正常情況下,其OD值變化不超過0.02。
實驗實例:
1. 稱取約0.1g三葉草組織,加入1mL提取液,進行冰浴勻漿,然后10000g,4℃,離心10min,取上清進行檢測,使用微量石英比色皿測得ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.8956-0.7839=0.1117,ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0853-0.077=0.0083,ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.1117-0.0083=0.1034,按樣本質量計算酶活得:GO酶活(U/g 質量)=392.16×ΔA÷W=405.4934 U/g 質量。
2. 稱取約0.1g菠菜組織,加入1mL提取液,進行冰浴勻漿,然后10000g,4℃,離心10min,取上清稀釋2倍進行檢測,使用微量石英比色皿測得ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.9286-0.8105=0.1181,ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0853-0.077=0.0083,ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.1181-0.0083=0.1098,按樣本質量計算酶活得:GO酶活(U/g質量)=392.16×ΔA÷W×2(稀釋倍數)=861.1834 U/g質量。
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