濾紙酶檢測試劑盒（微量法）

注意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品貨號：BA1203

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

測定意義：

纖維素酶是由微生物產(chǎn)生的多組分的酶系，能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，研究濾紙酶活力對纖維素酶的研究具有非常重要的意義。

測定原理：

濾紙酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在540nm處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與還原糖的量成正比，可測定計算得濾紙酶的活力。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體40mL×1瓶，4℃保存。

濾紙條：50mg×50條。

需自備的儀器和用品：

天平、研缽、低溫離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

酶液提?。?/span>

1.  組織：按照質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于4℃，12000rpm離心10min，取上清置于冰上待測。

2.  細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：蒸餾水體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，12000rpm離心10min，取上清置于冰上待測。

3.  培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測。

測定操作：

1.  根據(jù)樣本數(shù)量取兩倍數(shù)量的濾紙條和Ep管，每支Ep管中放入一個卷狀濾紙條（注意要放入底部），作為底物。2.  對照管：取200μL滅活的酶液，加入500μL試劑一，充分混勻，再加入放有濾紙條的Ep管中，標(biāo)注為對照管。3.  測定管：取200μL酶液，加入500μL試劑一，充分混勻，再加入放有濾紙條的Ep管中，標(biāo)注為測定管。

4.  對照管和測定管同時置于50℃水浴鍋中反應(yīng)30min。

5.  加入800μL試劑二，沸水浴5min，自來水冷卻后取200μL于微量石英比色皿/96孔板中測定540nm處吸光值，分別記為A對照管和A測定管，△A=A測定管-A對照管。

酶活性計算公式：

a.     用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.2805x-0.0255，R²=0.9991

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷0.2805×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

=0.891×（△A+0.0255）÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷0.2805×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

=0.891×（△A+0.0255）÷W

（3）按液體體積計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷0.2805×V反總÷V樣÷T

=0.891×（△A+0.0255）

（4）按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每10⁴個細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/10⁴cell）=（△A+0.0255）÷0.2805×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量（萬個）÷V樣總）÷T

=0.891×（△A+0.0255）÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

V反總：反應(yīng)總體積，1.5mL，V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.2mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，30min

b.     用96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.1403x-0.0255，R²=0.9991

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷0.1403×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

=1.782×（△A+0.0255）÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷0.1403×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

=1.782×（△A+0.0255）÷W

（3）按液體體積計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷0.1403×V反總÷V樣÷T

=1.782×（△A+0.0255）

（4）按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每10⁴個細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/10⁴cell）=（△A+0.0255）÷0.1403×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量（萬個）÷V樣總）÷T

=1.782×（△A+0.0255）÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

V反總：反應(yīng)總體積，1.5mL，V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.2mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，30min

注意事項：

1.  用干凈的鑷子取出濾紙條，帶手套卷成卷放入Ep管底部。

2.  樣本滅活時保證同一批樣本處理時間一致，建議沸水浴十分鐘。

3.  批量樣本測定之前先做1-2個樣本的預(yù)實驗，若吸光值超過1.2，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

顯色后取檢測液時注意槍頭不要碰到濾紙條，以免帶入毛狀物，影響測定結(jié)果。