谷氨酸合成酶（GOGAT）活性檢測試劑盒（紫外分光光度法）

注意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品貨號：BA1121

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡介：

GOGAT主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非綠色組織的前質(zhì)體中，和谷氨酰胺合成酶（GS）共同構(gòu)成GS/GOGAT循環(huán)，參與氨同化的調(diào)控。

GOGAT以NADH為電子供體，催化谷氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸形成兩分子的谷氨酸，NADH在340nm 吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存； 

試劑二：粉劑×2支，4℃保存；

試劑三：粉劑×2支，4℃保存；

試劑四：粉劑×2支，-20℃保存。

工作液的配制：取試劑二、試劑三、試劑四各一支加入30mL試劑一中溶解。現(xiàn)用現(xiàn)配。可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟：

1、 紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液提前配置，平衡至室溫。

3、 樣本測定：

三、GOGAT活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GOGAT（U/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGAT（U/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGAT（U/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.643×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1、 測定期間樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2、 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3、 當(dāng)A1大于1.5或者ΔA大于0.6時，建議將樣品用蒸餾水稀釋后測定，當(dāng)ΔA過小時，可以延長酶促反應(yīng)時間（10min或15min）或者加大加入的樣品體積進行測量。

4、 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣品蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。