二胺氧化酶活性檢測試劑盒 （微量法）

注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。

產品貨號：BA1090

產品規(guī)格：100管/48樣

產品簡介：

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動物（腸粘膜、肺、肝臟、腎臟等）、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛，其活性與核酸和蛋白合成密切相關，能夠反映腸道機械屏障的完整性和受損傷程度。

DAO催化尸胺產生醛和過氧化氫，外源添加過量的辣根過氧化物酶，催化過氧化氫氧化鄰聯茴香胺生成有色物質，在500nm處有特征吸收峰，通過測定該波長吸光度增加速率，計算DAO活性。

產品內容：

提取液：液體70mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體0.25mL×1支，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，使用時加2mL水溶解，4℃可保存1個月。

試劑三：液體1mL×1支，4℃保存。

需自備的儀器和用品：

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、96孔板/玻璃比色皿、蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

二、測定操作表：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至500nm，蒸餾水調零。

2、操作表

三、酶活性計算公式：

a. 使用96孔板測定的計算公式如下

1、動物組織DAO活力的計算

（1）按蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生1μmol氧化型鄰聯茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO（U/mg prot）=ΔA÷d÷ε×V反總÷(cpr×V樣本)÷T=30×ΔA÷cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1μmol氧化型鄰聯茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO（U/g 鮮重）=ΔA÷d÷ε×V反總÷(W÷V提取×V樣本)÷T=30×ΔA÷W

2、血清（漿）DAO活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）在反應體系中每分鐘催化產生1μmol氧化型鄰聯茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO（U/L）=ΔA÷d÷ε×V反總÷V樣本÷T=30×ΔA

3、按細胞數量計算：

單位的定義：每10⁴個細胞在反應體系中每分鐘催化產生1μmol氧化型鄰聯茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO活性（U/10⁴cell）=ΔA÷d÷ε×V反總÷（500×V樣÷V提取）÷T= 0.06×ΔA

V反總：反應總體積，0.2 mL；V樣本：加入粗酶液體積，0.05mL；V提取，加入提取液體積，1mL；cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；d：光徑，0.6cm；ε：氧化型鄰聯茴香胺消光系數，7.5×10^-3mL/μmol/cm；T：反應時間，30min。

b. 使用比色皿測定的計算公式如下

1、動物組織DAO活力的計算

（1）按蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生1μmol氧化型鄰聯茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO（U/mg prot）=ΔA÷d÷ε×V反總÷(cpr×V樣本)÷T=18×ΔA÷cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1μmol氧化型鄰聯茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO（U/g 鮮重）=ΔA÷d÷ε×V反總÷(W÷V提取×V樣本)÷T=18×ΔA÷W

2、血清（漿）DAO活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）在反應體系中每分鐘催化產生1μmol氧化型鄰聯茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO（U/L）=ΔA÷d÷ε×V反總÷V樣本÷T=18×ΔA

3、按細胞數量計算：

單位的定義：每10⁴個細胞在反應體系中每分鐘催化產生1μmol氧化型鄰聯茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO 活性（U/10⁴cell）=ΔA÷d÷ε×V反總÷（500×V樣÷V提取）÷T= 0.036×ΔA

V反總：反應總體積，0.2 mL；V樣本：加入粗酶液體積，0.05mL；V提取，加入提取液體積，1mL；cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；d：光徑，1cm；ε：氧化型鄰聯茴香胺消光系數，7.5×10^-3mL/μmol/cm；T：反應時間，30min。

注意事項：

1、如果OD值小于0.01，適當加大提取用樣本質量；OD值大于0.8，粗酶液可適當稀釋，或者減少提取用樣品質量。

2、樣品蛋白質含量需要另外測定。