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BA1046(AND)
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上海市
100管/48樣 2220元 999盒可售
更新時(shí)間:2022-02-17 16:50:12瀏覽次數(shù):153次
聯(lián)系我時(shí),請(qǐng)告知來自 化工儀器網(wǎng)供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100管/48樣 |
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貨號(hào) | BA1046 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
氨基比林-N-去甲基化酶(AND)活性檢測(cè)試劑盒(微量法)
注意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
產(chǎn)品貨號(hào):BA1046
產(chǎn)品規(guī)格:100管/48樣
產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
細(xì)胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中,尤其是藥物和毒物,具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員,相當(dāng)于CYP3A4亞型,與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。
AND催化氨基比林釋放甲醛,通過Nash比色法測(cè)定甲醛含量,即可計(jì)算出AND活性。
產(chǎn)品組成:
試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1管,4℃避光保存。臨用前加入1mL無水乙醇,充分溶解。
試劑四:粉×1管,4℃保存。臨用前加入0.5mL蒸餾水,充分溶解。
試劑五:粉劑×1瓶,室溫保存。臨用前加蒸餾水4mL充分溶解。
試劑六:液體×1瓶,室溫保存。
試劑七:液×1瓶,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)液:液體×1瓶,-20℃保存。臨用前取1.5mLEP管,加入10µl標(biāo)準(zhǔn)液,加990µl蒸餾水,混勻即為0.05mmol/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液,4℃保存。
需自備的儀器和用品:
普通離心機(jī),超速離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇和冰。
操作步驟:
一、粗酶液提取:
1. 除去細(xì)胞核,線粒體等大分子物質(zhì):稱約0.5g組織,加入1mL試劑一,冰上充分研磨,10000g 4℃離心30min,取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。
2. 粗制微粒體:4℃,100000g,離心60min,棄上清液。
3. 除血紅蛋白等雜質(zhì):向步驟2的沉淀中加1mL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100000g離心30min,棄上清液。
4. 最終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL,蓋緊后充分震蕩溶解,即粗酶液,待測(cè)。該待測(cè)液需當(dāng)天使用。
二、AND活性測(cè)定步驟:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min。
3. 對(duì)照管:取1支EP管,加入10µL粗酶液,170µL試劑二,10µL試劑三,10µL蒸餾水,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35µL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35µL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取新的EP管,加入100µL上清液,100µL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測(cè)定光吸收,記為A對(duì)照管。
4. 測(cè)定管:取1支EP管,加入10µL粗酶液,170µL試劑二,10µL試劑三,10µL試劑四,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35µL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35µL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取1支新EP管,加入100µL上清液,100µL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測(cè)定光吸收,記為A測(cè)定管。
5. 標(biāo)準(zhǔn)管:取1支EP管,加入100µL標(biāo)準(zhǔn)品,100µL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷
卻5min,于412nm測(cè)定光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
注意:每個(gè)樣品都需要做對(duì)照管。
三、AND活性計(jì)算:
a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。
AND活性(nmol/min/mg prot)=C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(Cpr×V樣)÷T
=45×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。
AND活性(nmol/min/g鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=22.5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W。
C標(biāo)準(zhǔn)品:0.05 mmol/L=50µmol/L;
V標(biāo)準(zhǔn)品:100µL=0.0001 L;
稀釋倍數(shù):V反總÷V上清液=(10+170+10+10+35+35)÷100=2.7;
Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒;
V樣:加入粗酶液體積,10µL=0.01mL;
V樣總:提取液體積,0.5mL;
W:樣本質(zhì)量,g ;
T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),30min。
b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。
AND活性(nmol/min/mg prot)=C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(Cpr×V樣)÷T
=45×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷ A標(biāo)準(zhǔn)管÷ Cpr。
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。
AND活性(nmol/min/g鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(V樣÷V樣總×W)÷T =22.5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷ A標(biāo)準(zhǔn)管÷W。
C標(biāo)準(zhǔn)品:0.05 mmol/L=50µmol/L;
V標(biāo)準(zhǔn)品:100µL=0.0001 L;
稀釋倍數(shù):V反總÷V上清液=(50+850+50+50+175+175)÷500=2.7;
Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒;
V樣:加入粗酶液體積,10µL=0.01mL;
V樣總:提取液體積,0.5mL;
W:樣本質(zhì)量,g ;
T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),30min。
注意事項(xiàng):
1. 粗酶液需在當(dāng)日完成測(cè)定,如需保存,則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油,分裝后,-80℃保存;
2. 試劑三和試劑四需臨用前配制,如當(dāng)天沒有用完,4℃避光保存,可用1周;
3. 粗酶液可直接用于蛋白濃度測(cè)定,建議用BCA法測(cè)蛋白含量。
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