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供貨周期 | 現貨 | 規格 | 48T/96T |
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貨號 | BA1790 | 應用領域 | 化工,生物產業 |
γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)檢測試劑盒(比色法)
產品貨號:BA1790
產品規格:48T/96T
檢測原理:
γ-GT是γ-谷氨酰循環中的關鍵酶,催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基轉移到受體。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,產生谷氨酸鹽,在細胞外谷胱甘肽新陳代謝中起了重要的作用。
γ-GT催化谷氨酰對硝基苯胺中γ-谷氨酰基轉移給N-甘氨酰甘氨酸,生成對硝基苯胺,在405nm有特征光吸收;通過測定405nm光吸收增加速率,來計算γ-GT酶活性。
試劑組成:
成份 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體50mL×1瓶 | 2-8℃ |
試劑一 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃ |
試劑二 | 液體12.5mL×1瓶 | 2-8℃ |
試劑三 | 液體44.5mL×1瓶 | 2-8℃ |
工作液(在試劑一瓶中配制):臨用前配制,把試劑二倒入試劑一瓶中,充分溶解 (室溫過低時可以40℃水浴促進溶解);然后把試劑三倒入試劑一瓶中,混勻后室溫保存。 |
需要而未提供的試劑和器材:
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
樣本處理:
1. 細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(10個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);10000rpm 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 組織:稱取約0.1g樣品,加提取液1.0 mL充分研磨,于4℃,10000rpm離心15min,取上清液待測。
3. 血清(漿):直接檢測。
操作步驟:
※正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。
1. 分光光度計預熱30min以上,調節波長至405nm,蒸餾水調零。
2. 試劑二置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)水浴中預熱30min以上(保證無沉淀)。
3. 按順序加入下列試劑,完成測定。
試劑(μL) | 測定管 | 空白管 |
樣本 | 100 | - |
蒸餾水 | - | 100 |
工作液 | 900 | 900 |
混勻后于405nm測定10s時的吸光度,記為A1。吹打混勻后測量130s時的吸光度,記為A2。 計算ΔA測定=A測2-A測1,ΔA空白=A空2-A空1,計算ΔA =ΔA測定-ΔA空白。 |
活性計算:
1. γ-GT活性計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
活性單位(U)定義:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為一個活性單位。
γ-GT(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×106×V反總÷(Cpr×V樣)÷T=0.506×ΔA÷Cpr
(2)按樣本質量計算:
活性單位(U)定義:25℃或者37℃中,每克組織每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為一個活性單位。
γ-GT(U/g 質量)=ΔA÷(ε×d)×106×V反總÷(W÷V提取×V樣)÷T=0.506×ΔA÷W
(3)按血清(漿)計算:
活性單位(U)定義:25℃或者37℃中,每毫升血清每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為一個活性單位。
γ-GT(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×106×V反總÷V樣÷T=0.506×ΔA
(4)按細菌或培養細胞計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為一個活性單位。
γ-GT(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×106÷(500×V樣÷V提取) ÷T=0.001×ΔA
V樣:加入樣品體積,0.1mL;V提取:加入提取液體積:1mL;T:反應時間,2min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:500萬細胞;ε:對硝基苯胺消光系數,9870L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應體系總體積,0.001L;106:單位換算系數,1mol=106μmol
注意事項:
1. 培養細胞中γ-GT活性測定時,細胞中γ-GT的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細胞裂解液處理細胞(防止因為蛋白質變性導致酶失活)。
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