石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒

產品貨號：BA1793

產品規格：50T

產品簡介：

從固定在福爾馬林中提取和純化出來的蛋白，可用于western blot，RPA，質譜，2D電泳分析。

產品組成： 

試劑盒成分保存

提取緩沖液EXB應存放在-20°C。FFPE試劑盒中其它的組分應存放在室溫干燥環境(15-25°C)。FFPE中的其它成分正庚烷,甲醇，氯仿應儲存在適當的儲藏柜中，此條件下，該試劑盒至少可以穩定保存12個月。

載玻片上的石蠟組織切片脫蠟:

用戶須自備的設備和試劑：

100%，96%，和70%(V/V)乙醇

石蠟包埋切片脫蠟罐

實驗開始前注意事項:

二甲苯清洗(步驟1和2)應在通風櫥內進行。

實驗步驟

1. 將載玻片轉移到一個合適的裝有二甲苯的容器中，玻片要被二甲苯*覆蓋，室溫(15-25°)孵育10min。

2. 重復步驟1兩次，每次使用新的二甲苯。

3. 將玻片放入100%乙醇中室溫孵育10min，使用新的100%乙醇重復此步。

4. 將玻片轉移到一個含有96%的乙醇的容器中孵育10min，使用新的96%乙醇重復這一步驟。

5. 將玻片轉移到一個含有70%的乙醇的容器中孵育10min，使用新的70%乙醇重復這一步驟。

6. 浸在雙蒸餾水中30s，用紙巾小心地擦去玻片上的水。

注意：紙巾不要觸碰到組織，確保組織不要干。

7. 用針劃要的組織轉移到離心管中。

8. 從FFPE組織切片中提取的總蛋白可進行western blot。

直接從一塊石蠟包理樣本中脫蠟:

用戶須自備的設備和試劑：

微型離心機(適合于1.5ml離心管)

渦旋混合器

100%，96%，and70%(vv)乙醇

實驗開始前注意事項：

所有離心步驟都是在20-25°C使用臺式進行離心(例如，Eppendorf® Micro Centrifuge 5417C or HeraeusBiofuge® 15 )。

二甲苯洗滌應在通風櫥內進行。

實驗步驟:

1. 從同一塊組織中切3片10-15m厚切片。

2. 立即把切片放在1.5毫升離心管中(提供)。

3. 向管子中加入1ml二甲苯，用力渦旋10s，孵育10min。

4. 將管子放入微型離心機中全速離心2min，小心棄掉上清。

5. 重復步驟3，4兩次。

6. 加入1ml無水乙醇到包含有顆粒的管子中，渦旋混勻。孵育10min，全速離心2min。

7. 小心棄掉上清。

8. 不要攪亂管底顆粒

9. 重復步驟6。

10. 加1mL96%乙醇到管中，渦旋混勻。孵育10分鐘，全速離心2min。

11. 小心棄掉上清。

12. 不要攪亂管底顆粒。

13. 重復步驟11，12。

14. 加1mL70%乙醇到管中，渦旋混勻。孵育10分鐘，全速離心2min。

15. 小心棄掉上清。

16. 不要攪亂管底顆粒。

17. 重復步驟14，15。

注意：如有必要，重復離心的步驟，盡量去除乙醇殘留。不要攪亂和棄掉管底顆粒。

18. 從FFPE組織切片中提取的總蛋白可進行進行westem blot。

從石蠟組織切片中提取的總蛋白用于western blot實驗:

用戶須自備的設備和試劑:

一次性手套

臺式離心機或微型離心機（轉速能達到14000xg）

渦旋混勻器

水浴或者金屬浴鍋（溫度能夠達到100℃）

熱電攪拌器(Eppendorf,德國)

實驗開始前注意事項

使用β-巰基乙醇應在通風櫥中操作

實驗開始前注意事項:

提供的提取緩沖液EXB未加β-巰基乙醇，每次提取過程中添加6μLβ-巰基乙醇到提取94μL的提取緩沖液EXB獲得工作液。

蛋白提取：

1. 取100μL提取緩沖液EXB(已加入β-巰基乙醇)加入到裝有組織的1.5ml的離心管中，渦旋混勻，用密封夾封號離心管。

2. 冰上孵育5min，渦旋混勻。

注意:確定離心管已經被密封好后在進行步驟3。

3. 將離心管放在水溶鍋中100°C孵育20min。

4. 使用熱電攪拌器，以750rpm速度，80℃，攪拌2h。

5. 然后將離心管放在4℃，1min，去掉密封夾。

6. 將離心管置于離心機中，4℃，14000xg，離心15min。

7. 轉移含所提蛋白質的上清液到一個新的1.5毫升的離心管中(提供)。

從FFPE組織中提取蛋白—用于雙向電或MS分析:

實驗開始前注意事項:

提供的提取緩沖液EXB未加β-巰基乙醇。每次提取過程中添加6μLβ-巰基乙醇到提取94μL的提取緩沖液EXB獲得工作液。

流程:

脫蠟:

1. 從同一塊組織中切3塊10-15μm厚切片。

注意：如果你不確定你的樣品中含有多少蛋白質，我們建議使用2個切片，每一個厚度為10um，面積100平方毫米制備。

2. 把切片在1.5毫升離心管中(提供)。

3. 吸取0.5mL的庚烷到管子中，蓋緊管子用力渦旋10s，室溫孵育1h(15-25℃)。

4. 加25μL甲醇，扣緊管子，大力渦旋10s。

5. 9000xg離心2分鐘。

管底會出現沉淀

6. 小心棄掉上清，在空氣中干燥5min。

蛋白提取

7. 取100μL提取緩沖液EXB(已加入β-巰基乙醇)加入到裝有組織的1.5mL的離心管中，渦旋混勻，用密封夾封號離心管。

8. 冰浴5min，然后渦旋混勻。

確保離心管密封好再進行步驟9。

9. 將離心管在100℃水浴鍋中孵育20min。

10. 使用熱電攪拌器，以750rpm速度，80℃，攪拌2h。

11. 然后將離心管放在4℃，1min，去掉密封夾。

在進行12步之前確定密封夾已經被去除。

12. 將離心管置于離心機中，4℃，14000xg，離心15min。轉移含所提蛋白質的上清液到一個新的1.5mL的離心管中(提供)。

雙向電泳蛋白樣品制備:

13. 加400μL甲醇到100μL步驟12所得的蛋白溶液中，扣緊蓋子，大力渦旋10s。

14. 9000xg離心10s。

15. 加100μL氯仿，扣緊管子，大力渦旋10s。

16. 9000xg離心10s。

17. 加300μL水，扣緊管子，用力渦旋10s。

18. 9000xg離心1min。

注意：離心后，樣品分為3層：最層，無色，有機相(氯仿)；中間層含蛋白質；上部，無色，水相。

19. 小心棄掉上層水相。

不要攪亂中間層和底層。

20. 加300μL甲醇，扣緊蓋子，大力渦旋。

21. 9000xg離心2min。

22. 小心棄掉上清。

注意:該蛋白是位于管子底部的可見的透明或白色凝膠狀沉淀。

23. 加入1mL乙醇到離心管中洗滌沉淀，而后9000xg離心2min，小心棄掉上清。

注意:不要使沉淀干燥

24. 加入適量體積的緩沖液溶解蛋白沉淀用于雙向電泳。

根據凝膠尺寸和染色方法，雙向電泳分析所需的蛋白質量從50-250μg。