順烏頭酸酶(ACO)活性檢測試劑盒(微量法)產品貨號：BA1881產品規格：100管/96樣產品簡介：順烏頭酸酶(aconitase)，三羧酸循環中的酶，催化檸檬酸轉變為異檸檬酸。檸檬酸本身不易氧化，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應，使羥基由β碳原子轉移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進一步的氧化脫羧反應作準備。ACO催化檸檬酸轉化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將NAD+還原生成NADH，導致340nm處光吸收上升。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。產品組成：試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存；試劑二：20mL×1瓶，-20℃保存；試劑三：1.5mL×1支，-20℃保存；試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；試劑五：液體5mL×1瓶，4℃保存；試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加1.5mL蒸餾水充分溶解；現配現用試劑七：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加12mL試劑四充分溶解；工作液：臨用前在12mL試劑七中加入1mL蒸餾水、1mL試劑四、1mL試劑五、1mL試劑六充分混勻。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。樣本的前處理：1. 組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：2. 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10μL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。3. 將勻漿轉入離心管內600g，4℃離心5min。4. 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。5. 上清液即胞漿提取物，可用于測定胞質順烏頭酸酶活性。6. 在步驟④的沉淀中加入200μL試劑二和2μL試劑三，超聲波破碎(冰浴，功率20%或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次)，用于線粒體順烏頭酸酶活性測定。測定步驟：1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。2. 樣本測定(1)將工作液，置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min；現配現用；若分次用將工作液分裝后于-20℃保存，一星期內可用。(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入40μL樣本160μL工作液，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和3min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。ACO活性計算：a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下(1)按樣本蛋白濃度計算單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO活性(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)÷T=268×ΔA÷Cpr(2)按樣本鮮重計算單位的定義：每g組織每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO(nmol/min/g鮮重)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=54×ΔA÷W(3)按細菌或細胞密度計算單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO活性(nmol/min/104cell)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.108×ΔAV反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，0.202mL；T：反應時間，3min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。b.用96孔板測定的計算公式如下(1)按樣本蛋白濃度計算單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO活性(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=536×ΔA÷Cpr(2)按樣本鮮重計算單位的定義：每g組織每分鐘生成 1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO(nmol/min/g鮮重)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=108×ΔA÷W(3)按細菌或細胞密度計算單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO活性(nmol/min/104cell)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.216×ΔAV反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/ mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，0.202mL； T：反應時間，3min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。