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RIPA 裂解液(中)
產品貨號:T0013C
產品包裝:50ml/100ml/500ml
產品簡介:
多種成分均可以從細胞中提取總蛋白,如 Triton、SDS、NP-40 等。RIPA 裂解液(強)(RIPA Lysis Buffer) 是采用一種經典的細胞組織快速裂解并獲得總蛋白的裂解液,其裂解強度大于 NP-40 裂解液、RIPA 裂解液(中)。 所獲得的蛋白質可用于 Western,免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)等。
Medium RIPA Lysis Buffer 主要由 Tris 、NP-40、sodium deoxycholate 等組成,并含有多種蛋白酶抑制劑成分, 可以有效抑制蛋白的降解,并維持原有的蛋白間相互作用。
產品組成:
試劑名稱 | 50ml | 100ml | 500ml | 保存條件 |
---|---|---|---|---|
Weak RIPA Lysis Buffer | 50ml | 100ml | 500ml | -20℃ |
PMSF(100mM) | 0.75ml | 1.5ml | 7.5ml | -20℃ |
操作步驟(僅供參考):
(一)貼壁培養細胞
1. 取 Weak RIPA Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻,加入 PMSF,使 PMSF 終濃度為 1mM。
2. 去除貼壁細胞的培養液,用 PBS、NS 或無血清培養液清洗 1 次,低速離心,棄上清, 留取沉淀。
3. 按照 6 孔板每孔加入 150~250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,加入 Weak RIPA Lysis Buffer。移液器輕輕吹 打,使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上或 4℃裂解,通常裂解液作用于細胞 1~3s 內,細胞就會被裂解。 通常 6孔板每孔細胞加入 150μl 裂解液已經足夠,但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200~ 250μl。
4. 10000~12000g,4℃離心 5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。
5. 后續的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)懸浮培養細胞
1. 取 Weak RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻后,加入 PMSF,使 PMSF 終濃度為 1mM。
2. 低速離心懸浮細胞,棄上清,收集沉淀。
3. 用手指輕彈細胞,使其松散。按照 6 孔板每孔細胞加入 150~250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,加入 Weak RIPA Lysis Buffer 。通常 6 孔板每孔細胞加入 150μl 裂解液已經足夠,但如果細胞密度非常高可以適當加大 裂解液的用量到 200~250μl。再用手指輕彈以充分裂解細胞,充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。
4. 10000~12000g,4℃離心 5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。
5. 進行后續的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)組織樣本
1. 取 Enhanced Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻后,加入 PMSF,使 PMSF 終濃度為 1mM。
2. 把組織剪切成細小的碎片,越小越好。
3. 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織,迅速用液氮研磨,研磨過程盡量控制在 1~2min 之內,以 減少蛋白的降解。
4. 按照每 20mg 組織加入 150~250μl 裂解液的比例,加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃裂解 15~30min。
5. 步驟3、4亦可以采用如下過程:按照每20mg組織加入150~250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Weak RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,直至充分裂解,該過程盡量控制在 1~2min 之內,以減少蛋 白的降解。
6. 10000~12000g,4℃離心 5~10min(如無低溫離心機,室溫下離心亦可),取上清。
7. 進行后續的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事項:
1. 去除貼壁細胞的培養液后,如果血清中的蛋白沒有干擾,可以不用清洗。
2. 如果裂解不充分可以適當增加裂解液的用量,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量。
3. 如果細胞量較多,必需分裝成 50~100 萬細胞/離心管,然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分,而少量的 細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸,相對比較容易裂解充分。
4. 如果組織樣品本身非常細小,可以適當剪切后直接加入裂解液裂解,通過強烈 Vortex 使樣品裂解充分。然 后同樣離心取上清,用于后續實驗。直接裂解的優點是比較方便,不必使用勻漿器,缺點是不如使用勻漿器 那樣裂解得比較充分。
5. 溶解 RIPA Lysis Buffer 時,應盡量縮短溶解時間,避免有效成分失效。
6. 裂解產物中經常會出現一小團透明膠狀物,屬正常現象。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等的復合物。在 不檢測和基因組 DNA 結合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續實驗;如果需要檢測 和基因組結合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續實驗。 如果檢測一些常見的轉錄因子,例如 NF-KB、p53 等時,通常不必進行超聲處理,就可以檢測到這些轉錄因 子。
7. 細胞裂解的操作步驟,應置于冰上或 4℃進行。
有效期: 12 個月有效。
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