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3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)活性檢測試劑盒

（微量法）

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定。

產品貨號：BA1002

產品規格：100管/96樣

測定意義：

      GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關鍵酶，與糖異生途徑、體內血糖濃 度的維持和糖尿病的發生密切相關，在機體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發揮重要作用。

測定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和 NADH生成3磷酸甘油醛、無機磷和NAD，340nm處測定NADH的減少量可反映GADPH活性的高低。

需自備的儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾 水。

試劑的組成和配制：

                             提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

                             試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

                             試劑二：液體20mL×1 瓶，4℃保存；

                             試劑三：液體×1 支，4℃保存。

樣本的前處理：

1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10 4 個）：提取液體 積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功 率 20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）， 進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱10分鐘； 現配現用。

（2）在試劑三中加入500μL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑4℃保存一周。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL 樣本、5μL試劑三和190μL工作液，混勻，加入后一個試劑的同 時開始計時，記錄340nm處20s時的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，計算 ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算： 單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(V樣×Cpr) ÷T

                                                  ＝1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算 單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

                                              ＝1286×ΔA÷W 

（3）按細菌或細胞密度計算 單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

                                                ＝2.57×ΔA 

V反總：反應體系總體積，2×10 -4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10 3 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm； V樣：加入樣本體積，0.005 mL；

V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度， mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(V樣×Cpr) ÷T

                                                 ＝2572×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T

                                              ＝2572×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/10 4cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

                                                 ＝5.144×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10 -4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×10 3 L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm； V樣：加入樣本體積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度， mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。