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His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)
  • His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)
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貨物所在地:上海上海市

更新時間:2024-08-14 16:00:38

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His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)包含Ni-Agarose填料、親和柱空柱以及可溶性His融合蛋白純化所需的全部試劑(細(xì)菌裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液組分),使用方便。該鎳柱純化系統(tǒng)對6?His-tag蛋白具有顯著特異吸附能力,能夠高效一步純化帶有6個組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白。

His-Tagged Protein Purification Kit (Soluble Protein)

His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)

產(chǎn)品貨號:264215ml

產(chǎn)品簡介

His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)包含Ni-Agarose填料、親和柱空柱以及可溶性His融合蛋白純化所需的全部試劑(細(xì)菌裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液組分),使用方便。該鎳柱純化系統(tǒng)對6×His-tag蛋白具有顯著特異吸附能力,能夠高效一步純化帶有6個組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白。該系統(tǒng)具有4Ni2+螯合位點(diǎn),較只有3個螯合位點(diǎn)的Ni-IDA結(jié)合Ni2+ 更為牢固,有效防止純化過程中Ni2+脫落且增強(qiáng)對His標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力,提高純化效率。較高的基團(tuán)密度,大大提高了蛋白載量。該系統(tǒng)在天然或變性條件下,對來源于各種表達(dá)系統(tǒng)(如桿狀病毒,哺乳細(xì)胞,酵母以及細(xì)菌)中的His標(biāo)簽蛋白,均有很好的純化效果。本產(chǎn)品已螯合鎳離子,可直接用可溶性蛋白的純化,使用方便,快捷。

支持物: CL-6B瓊脂糖凝膠

載量: 20-30 mg His標(biāo)簽蛋白/ml填料

粒徑: 50-160 µm

產(chǎn)品內(nèi)容:

產(chǎn)品名稱

包裝

儲存條件

Ni-Agarose Resin

5 ml

2-8℃,避免冷凍

Bacterial Protein Extraction Reagent

65 ml

室溫

1 M Tris-HClpH7.9

15 ml

室溫

1 M Imidazole

65 ml

室溫

3 M NaCl

120 ml

室溫

Protease Inhibitor Cocktail

700 µl

-20℃

Affinity Column (12 ml)

1 set

室溫

操作步驟:

緩沖液的準(zhǔn)備    

可溶性蛋白純化緩沖液配方:

Component

Tris-HClpH7.9

Imidazole

NaCl

Soluble Binding Buffer

20mM

10mM

0.5 M

Soluble Elution Buffer

20mM

500mM

0.5 M

組裝層析柱

1. Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱,室溫靜置10分鐘,待凝膠與溶液分層后, 把底部的出液口打開,讓乙醇通過重力作用緩慢流出。

注意:

1)填料的上層是乙醇保護(hù)層,將填料和乙醇一起混勻,以每ml填料純化20-30mg His標(biāo)簽蛋 白計算,取需要的填料與乙醇的混合液加入層析柱。

2)如果乙醇不流出,可以給柱子一個外力,例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下,迫使乙醇流出。

3)本實(shí)驗(yàn)都是通過重力作用使溶液流出。

2. 向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后,再用10倍柱體積的 Binding Buffer平衡柱子,平衡結(jié)束后即可上樣。

注意:柱體積指的是填料的體積。

可溶性蛋白的純化

1. 收集菌體后,每100 mg菌體(濕重)加入1-5 ml細(xì)菌裂解液(每1 ml 細(xì)菌抽提試劑中已加入10 μl 白酶抑制劑混合物),超聲裂解菌體。

注意:

1)當(dāng)提取物粘度高或提取蛋白為包涵體時,建議加入DNase ILysozyme。每1 ml 細(xì)菌抽提試劑中加入1 μl DNase I1,000 U/ml),2 μl Lysozyme50 mg/ml

2)超聲過程中保持菌液處于冰浴中,超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率,探頭種類,容器的大小形狀,需實(shí)驗(yàn)中自己摸索,應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱,可分成短時間,多次超聲,通過一定的間隔時間避免溶液過熱。最終菌液變清即可。

2. 10000 rpm,4℃離心3分鐘,收集上清中的可溶性蛋白。

3. Binding Buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱,流速為10倍柱體積/小時,收集流穿液。

注意:

1)本試劑盒中附帶有一塊篩板,使用時先將篩板加至填料的上層,該篩板可用于雜質(zhì)較多的蛋白的過濾,防止過多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負(fù)載上柱,但是篩板放入柱子后就不易取出。

2)通過控制加入的菌體裂解液的速度來控制流速。

4. 使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子,洗去雜蛋白。

5. 使用適量Soluble Elution Buffer洗脫,收集洗脫峰。

  注意:洗脫峰可以分管收集,每1 ml收集1管,并采用蛋白監(jiān)測儀監(jiān)測,收集洗脫峰

6. 洗脫后,依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子,再用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒),封柱后2-8℃保存。

  注意:如果是分段梯度洗脫,最大洗脫緩沖液中咪唑濃度未達(dá)到500 mM時,則使用濃度為500 mM的咪唑進(jìn)行洗脫10倍柱體積后,再進(jìn)行第6步的操作

柱再生

當(dāng)填料使用多次后,結(jié)合效率會有所下降(表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍(lán)綠色), 可以用以下方法再生,提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

1. 使用2倍柱體積的6 M鹽酸胍沖洗后,使用3倍柱體積的去離子水沖洗。

2.  使用1倍柱體積的2% SDS沖洗。

3.  依次使用1倍柱體積的25%50%75%5倍柱體積的100%乙醇沖洗,再依次使用1倍柱體積的75%

50%25%的乙醇沖洗。

4. 使用1倍柱體積的去離子水沖洗。

5.  使用5倍柱體積含50 mM EDTA緩沖液(PH8.0)沖洗。

6.  使用3倍柱體積去離子水,3倍柱體積20%乙醇沖洗。

7.  2-8°C保存。

8. 再次使用前,需首先使用10倍柱體積去離子水沖洗,然后使用5個柱體積的50 mM NiSO4再生,3個柱體積的Binding Buffer平衡。

注意事項(xiàng):

1. 在純化之前采用電泳檢測蛋白的可溶性,本試劑盒只適合于可溶性蛋白的純化。

2. 緩沖液中不建議使用β-巰基乙醇、DTTEDTA

3. 整個純化過程中切忌凝膠脫水變干。

4. 為提高純化效率,首先確定Binding BufferElution Buffer中咪唑的最佳使用濃度。必要時可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度,Binding Buffer的范圍為0-10 mM,洗脫緩沖液的范圍為10-500 mM來進(jìn)行。并通過SDS-PAGEWestern Blotting來檢測目的蛋白的純度。

5. 請使用高純度的試劑配制緩沖液,并通過0.22µm或者0.45µm過濾器過濾。為避免柱子被堵塞,建議將裂解液進(jìn)行離心,或者使用0.22µm或者0.45µm過濾器過濾。

6. 柱再生時,保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。



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