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線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1法）

產(chǎn)品貨號：10235

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

產(chǎn)品簡介：線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測。 JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。可以檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測指標(biāo)。JC-1單體的最大激發(fā)波長為515nm ，最大發(fā)射波長為529nm ；JC-1聚合物的最大激發(fā)波長為585nm，最大發(fā)射波長為590nm。實(shí)際觀察時(shí)，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。本試劑盒提供了CCCP作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100個(gè)樣品；對于12孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測200個(gè)樣品。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品組成 規(guī)格JC-1（200×） 100μ L/管，共5管超純水 90mLJC-1染色緩沖液（5×） 80mLCCCP（10mM ） 20μL

操作步驟（僅供參考）：

1. JC-1染色工作液的配制：六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1mL，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推；對于細(xì)胞懸液每50～100萬細(xì)胞需0.5mL JC-1染色工作液。取適量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200 ×）加入8mL超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1 。然后再加入2mL JC-1染色緩沖液（5 ×），混勻后即為 JC-1染色工作液。

2. 陽性對照的設(shè)置：把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照1：1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM，處理細(xì)胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì)胞，通常10μM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會(huì)*喪失，JC-1染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān) 文獻(xiàn)資料決定。

3. 對于懸浮細(xì)胞：

（1）取10～60萬細(xì)胞，重懸于0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

（2）加入0.5mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20分鐘。

（3）在孵育期間，按照每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

（4）37℃孵育結(jié)束后，600g 4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

（5）用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入1mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4 ℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入1mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4 ℃離心3～4分鐘， 沉淀細(xì)胞，棄上清。

（6）再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測或流式細(xì)胞儀分析。

4. 對于貼壁細(xì)胞：

注意：對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

（1）對于六孔板的一個(gè)孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1mL細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

（2）加入1mL JC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。

（3）在孵育期間，按照每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

（4）37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。

（5）加入2mL細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

（6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5. 對于純化的線粒體：

（1）把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色緩沖液（1×）稀釋5倍。

（2）0.9mL 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1mL總蛋白量為10～100 μg純化的線粒體。

（2）用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描（time scan），激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為485nm時(shí)，可以在475～520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測。

（3）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

6. 熒光觀測和結(jié)果分析：檢測JC-1單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm；檢測JC-1聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm。注意：此處測定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-1單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置，如觀察GFP或FITC時(shí)的設(shè)置；檢測JC-1聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3時(shí)的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

注意事項(xiàng)：

1. JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2. 必須先把JC-1（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入 JC-1 染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-1染色緩沖液（1×）再加入JC-1（200×），這樣JC-1會(huì)很難充分溶解，會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測。

3. 裝載完JC-1后用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌時(shí)，使JC-1染色緩沖液（1×）保持4 ℃左右，此時(shí)的洗滌效果較好。

4. JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

5. 請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。

6. 如果發(fā)現(xiàn)JC-1染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在37℃加熱。

7. CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護(hù)。

8. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

保存條件：-20℃避光保存，盡量避免反復(fù)凍融，有效期一年。

超純水和JC-1染色緩沖液（5 ×）也可4℃保存。