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質(zhì)粒大量提取試劑盒

產(chǎn)品貨號：26243

產(chǎn)品規(guī)格：10T

產(chǎn)品簡介：本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物，一般從50-100ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可快速提取200-300μg高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA，提取率達85-90%。 使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、 連接和轉(zhuǎn)化等試驗。使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。產(chǎn)品組成：試劑名稱 10TRNaseA ( 10mg/ml ) 1ml溶液Ⅰ 60ml溶液Ⅱ 60ml溶液Ⅲ 80ml漂洗液 2×15ml洗脫液 30ml吸附柱 10 個收集管(50ml) 10 個

操作步驟：

1. 收集 50-100ml 過夜培養(yǎng)的菌液 11000rpm 離心 10 分鐘，盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中)。

   2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入 5ml 溶液Ⅰ (請先檢查是否已加入 RNaseA) ，使用移液器或渦旋振蕩器*懸浮細菌細胞沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

2. 3. 向離心管中加入 5ml 溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次使菌體充分裂解。

   注意：

   ①翻轉(zhuǎn)一定要溫和，以免污染細菌基因組 DNA。

   ②作用時間不要超過 5 分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。

   4. 向離心管中加入 7ml 溶液Ⅲ ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀(如菌液過多，可在此步放置 5 分鐘，以盡可能的降解 RNA)。11000rpm 離心 10 分鐘，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，注意盡量不要吸出沉淀。

   注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。 如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

   5. 將上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置 2-3 分鐘，11000rpm 離心 30-60 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(如為提高得率，可將收集管中的液體加入吸附柱再次吸附一次)。6. 向吸附柱中加入 8ml 漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，11000rpm 離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

   7. 向吸附柱中加入 6ml 漂洗液，11000rpm 離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。8. 11000rpm 離心 5min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影晌后續(xù)的實驗如酶切、PCR 等。

   9. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 1-2ml 經(jīng) 65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置 5min，11000rpm 離心 2min，收集質(zhì)粒溶液用于后續(xù)實驗。

   10. 為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 5min，11000rpm 離心 2min。

   注意事項：

   1. 使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。

   2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 500ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的 pH 值對洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調(diào)至此范圍)， pH 值低于 7. 0 會降低洗脫效率。 DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA 降解。

   3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于 10kb 的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用 400-800ml 過夜培養(yǎng)物，同時按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當(dāng)?shù)难娱L時間，以增加提取效率。

   4. DNA 濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒 DNA 純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。得到的DNA 可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA 應(yīng)在 OD260 處有顯著吸收峰，OD260 值為 1 相當(dāng)于大約 50μg/ml 雙鏈 DNA、 40μg/ml 單鏈 DNA。OD260/OD280 比值應(yīng)為 1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為 pH 值和離子存在會影響吸光值，但并不表示純度低。

   保存條件：常溫保存，復(fù)檢期一年。