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硬組織線粒體分離試劑盒

產(chǎn)品貨號(hào)：10259

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

線粒體是細(xì)胞呼吸的主要場(chǎng)所，細(xì)胞活動(dòng)所需的能量主要由在線粒體內(nèi)進(jìn)行的氧化所產(chǎn)生的能量來供應(yīng)。制備線粒體的關(guān)鍵是保持線粒體的完整性和純度，可通過分級(jí)分離法獲得，即先低俗出去細(xì)胞核以及細(xì)胞碎片，再進(jìn)行高速梯度離心分離線粒體。尚寶生物 硬組織線粒體分離試劑盒(Hard Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分離動(dòng)物硬組織(如骨骼肌)中的線粒體的試劑盒，分離線粒體的同時(shí)可以獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，可用于分析細(xì)胞色素C等線粒體蛋白向胞漿的釋放，大部分獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能(如檢測(cè)線粒體膜電位)，獲得的蛋白可用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。該試劑盒適用于從動(dòng)物硬組織(心肌、骨骼肌)或其他難以分離線粒體的組織中提取線粒體。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。產(chǎn)品組成：試劑名稱 50T 100T 保存條件試劑(A): Wash buffer 100ml 200ml -20℃試劑(B): Mitochondria Lysis buffer 50ml 100ml -20℃試劑(C): Mitochondria Stock buffer 50ml 100ml -20℃試劑(D): Protein Stock buffer (5×) 10ml 20ml 室溫試劑(E): PMSF(100×) 1.5ml 3ml -20℃

自備材料：

1. 低溫離心機(jī)、勻漿器

2. 尼龍網(wǎng)或細(xì)胞篩

操作步驟 (僅供參考) ：

1. 清洗：動(dòng)物禁食 24h 后處死，取新鮮橫紋肌等組織，迅速稱重 50～100mg，用預(yù)冷的 Wash buffer 清洗 2 次，棄 Wash buffer，冰上剪成 30mm 大小的組織碎片。

2. 裂解：加入 10 倍體積的預(yù)冷的 Mitochondria Lysis buffer，置于冰浴 5～10min。

3. 勻漿Ⅰ：轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 Dounce 勻漿器中，勻漿 10～20 次，或采用電動(dòng)勻漿器，700rpm，8～10 次。不同組織或不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。

4. 勻漿Ⅱ：4℃攪拌孵育 5～10min。用等體積的 Mitochondria Stock buffer 秲釋至勻漿液，再次重復(fù)步驟 3。

5. 離心：用尼龍網(wǎng)或細(xì)胞篩過濾勻漿液，4℃，1000g 離心 15min，重復(fù) 1 次，以去除細(xì)胞核、未破碎的細(xì)胞和大的膜碎片。注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為 2000g 離心 10min，其缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會(huì)下降。

6. 上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃ 12000g 離心 10min。

注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為 6000g 離心 10min，其缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會(huì)下降。

7. 棄上清，沉淀為線粒體，如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，應(yīng)在本步驟中收集上清，并且在收集上清時(shí)注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清 12000g，4℃離心 10min，上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。

8. 保存：棄上清，用適當(dāng)緩沖液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能的分析，線粒體沉淀應(yīng)重懸于Mitochondria Stock buffer；如果用于線粒體蛋白的分析，獲得的細(xì)胞漿蛋白應(yīng)保存于 1×Protein Stock buffer，即按細(xì)胞漿蛋白：Protein Stock buffer (5×)=1:4 比例混合；如果用于雙向電泳，應(yīng)使用恰當(dāng)?shù)谋４嬉骸?/p>

注意事項(xiàng)：

1. 試劑 (如 PMSF)對(duì)于不同實(shí)驗(yàn)不必全部使用，在實(shí)驗(yàn)條件成熟后可以不必使用。

2. 如果不是用于制備線粒體蛋白，Mitochondria Lysis buffer 和 Mitochondria Stock buffer 不必加入 PMSF。如果用于制備線粒體蛋白樣品，Mitochondria Lysis buffer 和 Mitochondria Stock buffer 需添加 PMSF。PMSF 一定要在試劑加入到樣品中前 1～2min 內(nèi)加入，以免 PMSF 在水溶液中很快失效。

3. 分離線粒體的所有步驟均需在冰上或 4℃進(jìn)行，所用溶液需冰浴或 4℃預(yù)冷，全部操作時(shí)間盡量控制在 1h 以內(nèi)。

4. 通常在分離線粒體時(shí)前后兩次離心速度選取 1000g 和 12000g，如果希望純度更高，但對(duì)線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可用 2000g 和 6000g。

有效期：12 個(gè)月有效。