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一步法感受態細菌制備試劑盒

產品貨號：11127

產品規格：100T/500T

產品簡介：

一步法感受態細菌制備試劑盒(One Step Competent Cell Preparation Kit) 是一種用于大腸桿菌感受態細菌快速制備的試劑盒。是在經典的TSS法的基礎上進行適當改良而成，既繼承了TSS法的快速和簡便，又在此基礎上提高了感受態細菌的轉化效率和易操作性。使用本試劑盒可以使感受態效率達到106以上。不僅可以轉化質粒，而且可以轉化普通的連接產物。另外，對細菌的培養條件要求比較寬松，培養的細菌只要處于對數期內就可以使用本試劑盒制備感受態細菌。使用本試劑盒操作非常簡單，細菌培養好后僅需十幾分鐘就可以完成感受態細菌的制備。本試劑盒適用于絕大部分常見的大腸桿菌，包括DH5α、JM109、TG1、HB101和XL-1等。對于一些用于蛋白表達或病毒質粒構建的特殊大腸桿菌也適用，制備出來的感受態菌轉化質?？隙]有問題，但如果轉化連接產物有時效果不如DH5α等其它常見的細菌。本試劑盒提供了DH5α甘油菌作為菌種，可以用于制備感受態細菌。本試劑盒可以分多次使用，共可以制備足夠進行200-400次轉化的感受態細菌。

產品組成：試劑名稱 100T 500T感受態制備試劑 5ml 25mlDH5α甘油菌 100μl 500μl

使用說明：

1. 涂平板：

為取得最佳的感受態效率，必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂 LB 平板，并培養過夜。

2. 接種：

取一有新鮮培養的菌種的 LB 平板，后續操作均在超凈臺內進行。把鑷子的頂端在 70%酒精中蘸一下，并在酒精燈上略略燒一下，使鑷子的頂端處于無菌狀態。用鑷子夾取一個無菌的塑料槍頭或牙簽，從平板上挑取一個單克隆，然后把蘸有菌種的塑料槍頭或牙簽放到裝有 3 毫升 LB 的細菌培養試管內。上述操作也可以使用接種環等進行操作。

3. 培養：

37℃約 200rpm 培養過夜，通常培養時間控制在 16 小時左右為宜。絕對不宜超過 18 小時。

4. 再接種培養：

根據需要制備的感受態細菌的量，按照 1:100 的比例用新鮮培養的過夜菌接種培養。例如取 500 微升的新鮮過夜菌到 50 毫升的 LB 中繼續 37℃約 200rpm 培養。通常在大約培養 2-2.5 小時后 OD600 可以達到 0.3-0.5。

5. 制備感受態細菌：

在培養的細菌 OD600 達到 0.3-0.5 時，4℃2000g 離心 5 分鐘收集細菌。 如果離心沉淀前的菌量為 50 毫升，按后續操作進行，如果是其它體積則按比例換算后進行后續操作。用 5 毫升預冷的 LB 重新懸浮起細菌沉淀，加入 5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受態制備試劑，混勻，冰浴放置 5 分鐘。然后再輕輕混勻，根據實驗需要適當分裝到 1.5 毫升或 0.5 毫升的離心管內后-70℃保存。注：如果以后會只做單管的轉化，可以分裝成每管最少 50 微升或 100 微升，如果以后一次性做多個轉化，可以每管分裝 500 微升或更大體積。-70℃保存后，感受態的效率會隨時間的推移逐漸下降，但通常在半年內使用轉化效率下降不會太多。總的來說，新鮮制備的感受態要比凍存的感受態轉化效率更高一些。

6. 感受態細菌的使用：

a.對于感受態細菌效率的測定或連接產物的轉化(其它如基因突變產物的轉化等參考連接產物進行)：

(a)在冰上緩慢融解感受態細菌(對于新鮮制備的感受態就可以直接使用了)，如果檢測感受態細菌的效率，加入100pg-10ng 質粒，但質粒的體積不宜超過感受態細菌量的 10%。如果轉化連接產物，每 100 微升感受態細菌加入10 微升連接產物。

(b)輕輕用手指彈動離心管，以混勻細菌和質?；蜻B接產物。冰浴或冰水浴放置 30 分鐘。

(c)42℃水浴，熱休克 2 分鐘。

(d)熱休克后立即置于冰水浴中，2 分鐘。

(e)加入 900 微升 LB，37℃200rpm 培養 1 小時。(f)如果檢測感受態效率，取 100 微升涂布到含有相應抗生素的 LB 平板上。如果轉化的是連接產物，2000-3000g離心 1 分鐘或更長時間使細菌充分沉淀下來。去除約 900-950 微升 LB 培養液。細菌沉淀用余下的 LB 培養液重懸，然后全部涂布到含有適當抗生素的 LB 平板上。37℃培養過夜。

b.對于質粒的轉化：

(a)融解感受態細菌，加入不少于 50ng 質粒到 50 或 100 微升感受態細菌中。質粒的量可以是 1 微克或更多，但體積不宜超過感受態細菌量的 10%。

(b)輕輕用手指彈動離心管，以混勻細菌和質粒。冰浴或冰水浴放置 10 分鐘。

(c)取全部菌液直接涂布到含有適當抗生素的 LB 平板上，37℃培養過夜。

注意事項：

需自行配制 LB 液體培養基和 LB 平板以用于細菌的培養和感受態效率的檢測。盡管經過我們的測試凡是處于對數期內的細菌都可以用于感受態細菌的制備，但如果細菌生長的 OD600 的值達到 0.3-0.5 左右時，制備出來的感受態效果較佳。在制備感受態細菌的過程中均使用不含抗生素的 LB。在使用感受態菌的過程中熱休克后的 37℃培養時也必須使用無抗生素的 LB，即便轉入的質粒是有抗性的。本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期：-20℃保存，一年有效。