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α-葡萄糖苷酶（α-GC）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1016

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入12mL雙蒸水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支，5μmol/mL的對(duì)硝基苯酚溶液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵生成葡萄糖，不僅與細(xì)胞壁的松弛或加固有關(guān)，而且與細(xì)胞識(shí)別和一些信號(hào)分子產(chǎn)生密切相關(guān)。

α-GC 分解對(duì)-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算α-GC 活性。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每1000萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），15000g，4℃，離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織的處理：稱取約0.2g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿；15000g，4℃，離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)備：取100μL標(biāo)準(zhǔn)液，加入到400μL 試劑三中，得到1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，十倍稀釋到100nmol/mL，用蒸餾水倍比稀釋：50、25、12.5、6.25、0 nmol/mL。100、50、25、12.5、6.25、0 nmol/mL做標(biāo)準(zhǔn)液。

二、測(cè)定步驟和加樣表：

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表

充分混勻，放入37℃準(zhǔn)確水浴30min后，立即放入沸水浴中煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

充分混勻，8000g，4℃，離心5min，取上清液（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置2min后， 400nm處測(cè)定吸光值A，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。

三、α-GC 活力計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（y）和吸光度（x，各標(biāo)準(zhǔn)管減去濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)管為標(biāo)準(zhǔn)管A），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA（x）帶入公式計(jì)算樣品產(chǎn)物濃度（nmol/mL）。

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL體系中每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

GC 活力(U/mg prot)=(y×V反總)÷(V樣×Cpr)÷T=18.67×y÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在每mL體系中每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

GC 活力(U/g鮮重) = (y×V反總)÷(W×V樣÷V樣總)÷T=18.67×y÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL體系中每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

GC 活力(U/10⁴ cell)=(y×V反總)÷(1000×V樣÷V樣總)÷T=0.0187×y

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.28mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；1000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，1000萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h。