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丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(微量法)
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定。
產品貨號:BA1066
產品規格:100管/96樣
產品內容:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體30mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×2瓶,4℃保存;
MDA檢測工作液的配制:用時在每瓶試劑二中加入15mL試劑一,溶解混勻,4℃保存待用。
試劑三:液體10mL×1瓶,4℃保存;
注意事項:MDA檢測工作液較難溶解,可以70℃加熱,并劇烈振蕩以促進溶解。或者通過超聲處理以促進溶解。
產品說明:
氧自由基作用于脂質的不飽和脂肪酸,生成過氧化脂質;后者逐漸分解為一系列復雜的化合物,其中包括丙二醛 MDA。通過檢測 MDA 的水平即可檢測脂質氧化的水平。
丙er醛(MDA)在酸性和高溫條件下,可以與硫代ba比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)縮合,生成棕紅色的san甲川(3,5,5-san甲基惡唑-2,4-er酮),其最大吸收波長在532nm。進行比色后可估測樣品中過氧化脂質的含量。但是測定植物組織中MDA時受多種物質的干擾,其中最主要的是可溶性糖,糖與TBA顯色反應產物的最大吸收波長在450nm,但532nm處也有吸收。所以同時測定600nm、532nm、450nm下的吸光度,利用532nm與450nm、600nm下的吸光度的差值計算MDA的含量。
由于植物中受蔗糖干擾較大,動物中受葡萄糖干擾較大,所以本試劑盒有針對蔗糖和葡萄糖的兩個公式。若所測樣品為油脂類物質,則兩個公式均可。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、MDA提取:
1、細菌或細胞樣品的制備:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照每400萬細菌或細胞加入1mL提取液,超聲波破碎細菌或細胞(功率20%,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 組織樣品的制備:稱取約0.1g組織,加入1mL提取液進行冰浴勻漿;8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
二、測定操作:
1、可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上,蒸餾水調零。
2、按下表步驟加樣:
試劑名稱 | 測定管 |
MDA檢測工作液(μL) | 300 |
樣本(μL) | 100 |
試劑三(μL) | 100 |
混合液在100℃水浴中保溫30min后(蓋緊,防止水分散失),置于冰浴中冷卻,10000g,常溫,離心10min。吸取200uL上清液于微量玻璃比色皿或96孔板中,測定各樣品在450nm、532nm和600nm處的吸光度。
三、MDA含量計算:
a. 按96孔板計算
1、細菌、細胞或動物組織中MDA含量計算
(1)按照蛋白濃度計算
MDA含量(nmol/ mg prot)=(12.9×(A532-A600)-2.58×A450)×V總÷(Cpr×V樣本)
=5×(12.9×(A532-A600)-2.58×A450)÷Cpr
(2)按照樣品質量計算
MDA 含量(nmol/ g 鮮重)=(12.9×(A532-A600)-2.58×A450)×V總÷(W×V樣本÷V提取)
=5×(12.9×(A532 -A600)-2.58×A450)÷W
(3) 按照細菌或細胞密度計算:
MDA 含量(nmol/104 cell)=(12.9×(A532-A600)-2.58×A450)×V總÷(400÷V提取×V樣本)
=0.125×(12.9×(A532-A600)-2.58×A450)
V總:反應體系總體積,0.5mL;V樣品:加入樣品體積,0.1 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL。 W:樣品質量,g;400:細胞或細菌總數,400萬;V提取:提取液體積,1mL。
2、植物組織中MDA含量計算
(1)按照樣品質量計算
MDA含量(nmol/ g鮮重)=(12.9×(A532-A600)-1.12×A450)×V總÷(W×V樣本÷V提取)
=5×(12.9×(A532-A600)-1.12×A450)÷W
(2)按照蛋白濃度計算
MDA含量(nmol/ mg prot)=(12.9×(A532-A600)-1.12×A450)×V總÷(Cpr×V樣本)
=5×(12.9×(A532-A600)-1.12×A450)÷Cpr
V總:反應體系總體積,0.5mL;V樣品:加入樣品體積,0.1 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL。W:樣品質量,g;V提取:提取液體積,1mL。
b. 按微量比色皿計算
1、細菌、細胞或動物組織中MDA含量計算
(1)按照蛋白濃度計算
MDA含量(nmol/ mg prot)=(6.45 ×(A532-A600)-1.29×A450)×V總÷(Cpr×V樣本)
=5×(6.45 ×(A532-A600)-1.29×A450)÷Cpr
(2)按照樣品質量計算
MDA含量(nmol/ g鮮重)=(6.45 ×(A532-A600)-1.29×A450)×V總÷(W×V樣本÷V提取)
=5×(6.45 ×(A532-A600)-1.29×A450)÷W
(3) 按照細菌或細胞密度計算:
MDA 含量(nmol/104 cell)=(6.45 ×(A532-A600)-1.29×A450)×V 總÷(400×V樣本÷V提取)
=0.0125×(6.45 ×(A532-A600)-1.29×A450)
V總:反應體系總體積,0.5mL;V樣品:加入樣品體積,0.1 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL。W:樣品質量,g;400:細胞或細菌總數,400萬;V提取:提取液體積,1mL。
2、植物組織中MDA含量計算
(1)按照樣品質量計算
MDA含量(nmol/ g鮮重)=(6.45 ×(A532-A600)-0.56×A450)×V總÷(W×V樣本÷V提取)
=5×(6.45 ×(A532-A600)-0.56×A450)÷W
(2)按照蛋白濃度計算
MDA含量(nmol/ mg prot)=(6.45 ×(A532-A600)-0.56×A450)×V總÷(Cpr×V樣本)
=5×(6.45 ×(A532-A600)-0.56×A450)÷Cpr
V總:反應體系總體積,0.5mL;V樣品:加入樣品體積,0.1 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL。W:樣品質量,g;V提取:提取液體積,1mL。
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