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超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(微量法)
注意:正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。
產(chǎn)品貨號:BA1068
產(chǎn)品規(guī)格:100管/48樣
產(chǎn)品簡介:
SOD(EC 1.15.1.1)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶,是重要的氧自由基清除劑,能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用,生成H2O2和O2。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶,也是H2O2主要生成酶,在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。
通過huang嘌呤及huang嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-),O2-可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜,后者在 560nm處有吸收;SOD可清除O2-,從而抑制了甲臜的形成;反應(yīng)液藍(lán)色越深,說明SOD活性愈低,反之活性越高。
產(chǎn)品內(nèi)容:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體5mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體100μL×1支,4℃保存;使用前先離心再吹打混勻。
試劑三:液體4mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:粉劑×1支,4℃保存。(由于試劑量極少,容易產(chǎn)生誤差,現(xiàn)規(guī)格為0.0003g/支,使用時(shí)稱取0.00003g即可。)
試劑五:液體2mL×1瓶,4℃保存;臨用前將試劑四加入試劑五中,并震蕩溶解。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣品的前處理:
(1) 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)胞、細(xì)菌樣本:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清,按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液,超聲波破碎(功率20%或200w,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次)。8000g 4℃離心10分鐘,取上清,置冰上待測。
組織樣本:稱取約0.1g組織,加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿; 8000g 4℃離心10分鐘,取上清,置冰上待測。
(2) 血清(漿)樣品:直接檢測。
二、測定步驟:
1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至560nm,蒸餾水調(diào)零。
2、測定前將試劑一、三和五37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min以上。
3、樣本測定(按順序加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 空白管1 | 空白管2 |
樣本 | 18 | 18 | - | - |
試劑一 | 45 | 45 | 45 | 45 |
試劑二 | 2 | - | 2 | - |
試劑三 | 35 | 35 | 35 | 35 |
蒸餾水 | 90 | 92 | 108 | 110 |
試劑五 | 10 | 10 | 10 | 10 |
充分混勻,37℃水浴30min后,560nm處測定各管吸光值A。計(jì)算ΔA測定=A測定-A對照,ΔA空白=A空1-A空2。如底部有沉淀,混勻后再行測定。
注意:
1、樣本和試劑二使用時(shí)在冰上放置。
2、樣本較多時(shí),可按表格配置工作液(包含試劑一、二、三),試劑五必須最后加入。
3、空白管1和空白管2各只需做1~2管;每個(gè)樣本有一個(gè)對照管。
4、反應(yīng)完成后,可能有沉淀生成,混勻后測定即可。
三、SOD活性計(jì)算:
1、抑制百分率的計(jì)算
抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白× 100%
盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi),越靠近50%越準(zhǔn)確。如果計(jì)算出來的抑制百分率小于30%或大于70%,則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高,則需適當(dāng)稀釋樣品;如果測定出來的抑制百分率偏低,則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測樣品。
2、SOD酶活性單位:在上述huang嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí),反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位。
3、SOD酶活性計(jì)算:
(1)血清(漿)SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷( 1-抑制百分率)×V反總]÷V樣×F
=11.11×抑制百分率÷( 1-抑制百分率)×F
(2)組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞SOD活力計(jì)算:
A:按樣本蛋白濃度計(jì)算
SOD活性 (U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(V樣×Cpr)×F
=11.11×抑制百分率÷( 1-抑制百分率) ÷Cpr×F
B:按樣本鮮重計(jì)算
SOD活性 (U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)×F
=11.11×抑制百分率÷( 1-抑制百分率) ÷W×F
C:按細(xì)菌或細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算
SOD =活力 (U/104 cell)= [抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)×F
=0.022×抑制百分率÷( 1-抑制百分率)×F
V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本的體積,0.018mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬,F:樣本稀釋倍數(shù)。
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