檢測限 (LOD, Limit of Detection) 是指分析方法能夠可靠檢測到的最小物質濃度或數量，代表著方法的靈敏度。對于藥物遞送和納米載藥系統，準確報告LOD不僅幫助確定檢測方法的準確性和可重復性，還關系到低濃度顆粒的檢測、監管合規性（進行藥品申報或質量控制時，監管機構如FDA、EMA等通常要求詳細報告顆粒表征方法的LOD）、方法驗證，以及科研成果的可信度。那么，市場上的各種顆粒表征方法或儀器，能否提供準確的LOD？它們的檢測原理和局限性是什么？接下來，和小編一起深入探討吧！
納米顆粒跟蹤分析（NTA）無法提供傳統意義上的LOD
納米顆粒跟蹤分析 (NTA, Nanoparticle Tracking Analysis) 是一種通過跟蹤并分析單個納米顆粒的布朗運動來測量粒徑和濃度的技術。盡管NTA能夠提供納米顆粒的粒徑分布和濃度信息，但由于以下原因，它無法提供傳統意義上的LOD：
NTA依賴于光散射來檢測顆粒，而不同顆粒的散射強度差異較大，尤其是在樣品中存在多分散性時，大顆粒散射光強往往將小顆粒信號遮擋，導致粒徑偏大，濃度偏低。因此，不同粒徑的顆粒可能會產生不同的信號強度，使得定義一個統一的LOD變得困難。
2、顆粒濃度影響：
NTA的檢測范圍受到顆粒濃度的限制。濃度過高時，大小顆粒之間的相互干擾會導致分析不準確；濃度過低時，無法檢測到足夠數量的顆粒亦會造成取樣誤差和隨機誤差（。因此，很難確定一個適用于所有樣品的低濃度檢測限（不同的樣本的LOD會有所不同）。同時，即便是純化后的細胞外囊泡這類明確的樣本其線性濃度區間也通常只能集中于一個數量級[1][2]。
3、光學系統的限制：
NTA的檢測靈敏度還取決于光學系統的分辨能力以及參數設定，特別是在檢測小尺寸的納米顆粒時。光學分辨能力的局限使得難以為NTA技術定義一個統一的LOD。
由于這些因素，NTA在粒徑和濃度表征種提供的是一種相對定量的結果，而非絕對的低檢測限。
動態光散射（DLS）的局限性
動態光散射 (DLS，Dynamic Light Scattering) 本質上是一種用于測量懸浮液中納米顆粒或大分子的擬合粒徑的方法。由于DLS依賴于顆粒散射光的強度，同樣的，在確定檢測限LOD上通常具有一定的局限性：
1、散射強度的依賴性：
DLS測量的是樣品中所有顆粒的平均布朗運動，因此，較小的顆粒或者低濃度的顆粒產生的散射信號可能被背景噪聲淹沒，難以準確檢測。一般來說，DLS的LOD對于顆粒濃度和粒徑范圍的要求要比人們通常理解的要高。
2、多分散性和濃度影響：
在多分散體系或濃度過低的樣品中，DLS難以區分各個不同大小的顆粒，因此難以準確給出一個統一的LOD。具體來說，DLS的原理假設樣本都是單分散大小分布的（PDI<0.1甚至要更小），而對于多分散的（例如大多數生物樣本）并不適合；另外雖然DLS原理并不能計算濃度數據，但是DLS測樣對濃度卻是有要求的，不合適的上樣濃度會導致粒徑上的巨大偏差，也容易被人忽視。
綜上，我們可以發現NTA和DLS均無法給出實際意義的LOD。這點在國際細胞外囊泡學會（ISEV，International Society for Extracellular Vesicles）發布的最新指南中也明確指出：需要公布檢測方法的LOD，從而允許其他人驗證結果，而不管靈敏度限制如何。但目前尚無方法為納米顆粒跟蹤分析（NTA）、動態光散射（DLS）或成像流式細胞術得出可追溯的LOD[3]。
電阻脈沖感應（RPS) 方法可以表示確定的LOD
電阻脈沖感應（RPS，Resistive Pulse Sensing）方法在納米顆粒的粒徑和濃度表征中均可以給出確定的LOD。RPS通過檢測單個顆粒通過微孔時引起的電阻變化來測量顆粒的尺寸和數量。因為它是單顆粒檢測方法，RPS在某些條件下可以提供非常低的檢測限，尤其適合檢測稀釋樣品中的低濃度顆粒。LOD通常與微孔或納米孔的大小和樣品中的噪聲水平相關聯。
依賴孔徑大小：
LOD通常與微孔的大小和樣品中的噪聲水平相關聯。較小的孔徑可以檢測到較小的顆粒，但同時也可能增加背景噪聲，從而影響LOD的準確性。
依賴噪聲水平：
樣品的電導性、孔道的表面特性以及背景電流的穩定性都會影響檢測限。如果背景噪聲低，RPS可以檢測到非常小且低濃度的顆粒，從而實現較低的LOD。
瑞芯智造NanoCoulter納米庫爾特粒度儀應用RPS技術，打破光學原理的局限性，經過十余年微納加工技術沉淀，創新光刻硅基固體納米孔芯片，將經典庫爾特技術的粒徑檢測范圍從微米級下探至納米級。同時依賴高靈敏皮安級電流檢測和信號噪音的分析處理可精準降噪分析每個過孔顆粒，真正意義上的單顆粒檢測，可精確分析粒徑分布廣的多分散樣本，具備更寬的粒徑LOD (15-2000 nm) 和極寬的濃度LOD (106-1012 particles/mL)。
參考文獻
[1] Welsh JA, Goberdhan DCI, O'Driscoll L, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches [published correction appears in J Extracell Vesicles. 2024 May;13(5):e12451. doi: 10.1002/jev2.12451]. J Extracell Vesicles. 2024;13(2):e12404.
[2] Li Y, Zhang S, Liu C, et al. Thermophoretic glycan profiling of extracellular vesicles for triple-negative breast cancer management. Nat Commun. 2024;15(1):2292.
[3] Tian Y, Tian D, Peng X, Qiu H. Critical parameters to standardize the size and concentration determination of nanomaterials by nanoparticle tracking analysis. Int J Pharm. 2024;656:124097.
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