純化的RNA的點(diǎn)雜交和狹線雜交

時(shí)間：2021/12/21閱讀：1100

原理

點(diǎn)雜交和狹線雜交技術(shù)（Kafatos et al. 1979) 用于在同一固相支持物（通常為帶電荷的尼龍膜）上固定幾種核酸樣品，然后用合適的探針與已固定的樣品雜交，并由此判斷靶序列的濃度。通過(guò)估計(jì)樣品點(diǎn)發(fā)射出的信號(hào)的強(qiáng)度，與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，確定待測(cè)樣品中靶序列的量。

材料與儀器

RNA 檢測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照探針標(biāo)記與變性
NaOH 預(yù)雜交液 RNA 變性液 SSC
印跡裝置絞鏈儀帶正電荷尼龍膜厚印透紙水浴鍋

步驟

一、材料

1. 緩沖液與溶液

NaOH ( 10 mol/L)

預(yù)雜交液

RNA 變性液

0.1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

0.1X SSC ( 含 1%SDS，m/V)

0.5X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

2X SSC

20X SSC

2. 核酸與寡聚核甘酸

RNA 檢測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照

3. 探針

探針標(biāo)記與變性

4. 專用設(shè)備

印跡裝置

絞鏈儀（如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-rad) 或真空爐、微波爐

帶正電荷尼龍膜

厚印透紙（如 Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)

預(yù)熱水浴鍋到 68℃

二、方法

安裝印跡裝置

1. 切一張合適大小的帶正電荷尼龍膜。用鉛筆標(biāo)上表示方向的記號(hào)。用水把膜簡(jiǎn)單弄濕，在 20X SSC 中室溫泡 1 h。

2. 在膜浸泡期間，先用 0.1 mol/L NaOH 小心清洗印跡裝置，再用無(wú)菌水洗干凈。

3. 把兩片厚濾紙用 20X SSC 浸濕，再放到真空器頂部。

4. 把樣品槽插入裝置的上部，把濕尼龍膜放在樣品槽加樣孔的底部，用吸管在膜的表面滾動(dòng)以去除膜與裝置夾層中的氣泡。

5. 加緊夾板，連接真空管。

6. 加入 10X SSC 直至液面沒(méi)過(guò)尼龍膜，關(guān)掉真空，再用 10X SSC 充滿。

RNA 樣品準(zhǔn)備

7. 把每個(gè) RNA 樣品（溶解在 10 μl 水）分別與 30 μl RNA 變性液混合。

8. 65℃ 溫育 5 min，然后在冰上冷卻。

9. 向每個(gè)樣品中加入等體積 20X SSC。

10. 輕輕向印跡裝置中吸入 10XSSC，直到淹沒(méi)尼龍膜。

RNA 樣品的印跡和 RNA 在膜上的固定

11. 把所有樣品輕輕加入狹線中，然后輕輕吸干膜。當(dāng)所有樣品都鋪到膜上后，每個(gè)狹線用 1 ml 10XSSC 洗兩次。

12. 當(dāng)?shù)诙蜗茨ね瓿珊螅^續(xù)輕輕吸干膜。

13. 取下膜，然后用紫外交聯(lián)、烘烤或微波照射把 RNA 固定在膜上。

固定化 RNA 的雜交與洗膜

14. 把膜放入烤盤(pán)或雜交爐中，加入 10~20 ml 預(yù)雜交液 68℃ 溫育 2 h。

15. 把已變性的放射性標(biāo)記的探針直接加到預(yù)雜交液中。在適當(dāng)?shù)臏囟认吕^續(xù)溫育 12~16 h。

16. 雜交完后從塑料袋中取出膜，然后盡可能快地把膜轉(zhuǎn)移到室溫下裝有 100~200 mJ、1X SSC ( 0.1% SDS) 的塑料容器中。蓋緊塑料容器，放到搖床上輕搖 10 min。

17. 把膜轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有 100~200 ml 的、預(yù)熱到 68℃ 的 0.5X SSC ( 含 0.1% SDS) 的塑料袋中，然后在此溫度下輕搖 10 min。

18. 按步驟 17 重復(fù)洗膜兩次，使總的洗膜次數(shù)達(dá)到三次。

19. 用濾紙吸干膜，在 -70℃ 條件下放射自顯影 24~48 h ( Kodak XAR-5 或相當(dāng)?shù)哪z片)。鎢酸鹽型的增感屏比舊式稀土型的效果更好。當(dāng)然，磷光成像儀也可以用來(lái)成像。

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