當前位置:深圳市安培生物科技有限公司>>技術文章>>IPS細胞怎么誘導分化?
IPSC生成通常是實現真正的實驗目標的中間步驟。
它一般應用于:
人胚胎發育建模;
作為難以分離的細胞來源,用于基礎研究和疾病建模;
藥物篩選應用;
細胞替代治療。
IPS神經分化的protocol,以下是神經細胞的分化操作步驟,可供參考:
準備好神經誘導分化的培養基,建議使用Essential 8TM培養基以Matrigel基質膠作為基質,或者使用StemPro hESC SFM培養基以Geltrex作為基質。
1、高品質的PSCs(無分化或者僅含少量分化的克隆)是進行有效的神經誘導的關鍵。在傳代PSCs時去除所有的或者大部分分化的克隆。分化的克隆可以通過使用Nikon顯微標志和Nikon顯微C-OA 15mm目標適配器被標記
2、當PSCs達到~70-80%融合時,根據PSC分種實驗方法將PSC接種到6孔板中在分種PSC團塊前,確定分種的密度,方法如下:
3、當準備好PSC細胞懸液后,取部分細胞到15-ml錐形管中來估算PSC細胞懸液的總細胞量(如,將6孔板的一個孔中的細胞制備成6ml PSC細胞懸液,鄧1ml來進行細胞數估算)。
4、將裝有細胞的15-ml錐形管以200×g離心3分鐘,棄上清。
5、加入1ml預熱的StemPro Accutase細胞消化液,37度孵育5分鐘。
6、用1ml的移液管上下猛烈的吹吸5次,將細胞分散成單個細胞懸液。
7、選擇你常用的方法計數總細胞數。如果在1ml Accutase細胞消化液中的總細胞數為1×10^6,那么剩下的5ml PSC細胞懸液中的總細胞數為1×10^6×5=5×10^6
8、加入2.5ml PSC培養基至包被好的6孔板的每個孔中。
9、溫和的混勻有PSC細胞懸液的錐形管,將PSCs以2.5×10^6-3×10^5的數量接種到每個孔中。例如,如果PSC懸液為1×10^6個細胞/ml,將0.25-0.3ml PSC懸液加入到每個孔中。
10、快速的前后左右晃動培養皿,將細胞分散到整個表面,于CO2培養箱中培養。
以下點需要注意:
1、分種 的比例根據在分種前PSCs的融合程度用PSC細胞系類型的不同而有所差異。在分種后的第一天即開始進行神經誘導(大約傳代后24小時)。在傳代PSCs時,PSCs的起始密度應該在15-25%的融合細胞需要以團塊狀接種,避免成為單個細胞。單個細胞接種PSC易增加細胞的死亡。
2、在分種的時候可以將10um ROCK抑制劑加入到PSC培養基中處理過夜,以防止細胞的死亡。
3、如果起始用的PCS狀態很差,非神經樣的克隆將會在培養中出現。在這種情況下,可以有兩種操作選擇:
a、如果僅在培養皿的極少區域出現該細胞形態,在挑除非神經樣分化的克隆后可以繼續培養。為了去除非神經樣分化的克隆,先用顯微標記出所有非神經樣分化的克隆。傾斜培養皿,用巴氏玻璃吸管將標記的克隆吸掉去除。將培養皿旋轉180度,重復以上步驟。操作每個孔時均重復以上步驟,以避免細胞缺少培養基而需經受無培養基壓力。
b、如果出現了大量的非神經樣的克隆,建議放棄繼續培養,而選擇高品質的PSCs重頭開始。
c、更換培養基一定要注意,請預熱*培養基,冰冷的培養基加入會導致細胞皺縮和漂浮。
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