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補體介導(dǎo)法

時間:2022/3/11閱讀:1092
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原理


帶有特異抗原的靶細(xì)胞(如正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞)與相應(yīng)抗體結(jié)合后,在補體的參與下,引起靶細(xì)胞膜損傷,導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加、細(xì)胞死亡。染料(例如:伊紅-Y、臺盼藍(lán))可通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞著色,故可用于指示死細(xì)胞或瀕死細(xì)胞,而活細(xì)胞不著色。此即補體依賴性細(xì)胞毒試驗,利用細(xì)胞毒試驗可以檢查細(xì)胞膜抗原,亦可鑒定抗體的特異性。
 
本實驗中,Thy-1抗原是小鼠胸腺T細(xì)胞特異的表面抗原,在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補體的協(xié)同作用,可殺傷95%以上的胸腺細(xì)胞。
 


材料與儀器

C57BL/6J小鼠
Hank’s液 單克隆抗體 補體 伊紅-Y染液
眼科剪 眼科鑷 平皿 不銹鋼網(wǎng) 試管 吸量管 尖吸管 載玻片 蓋玻片 顯微鏡

步驟


一、實驗方法
 
1.  小鼠胸腺細(xì)胞懸液的制備:將4~6周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死,取出胸腺放入已加入約4 ml冷Hank’s液的平皿中,在100目的不銹鋼網(wǎng)上研磨后,過篩,放入試管,離心1 000 rpm,5分鐘,用Hank’s液洗兩次。將沉淀的細(xì)胞重懸于Hank’s液中,配成1×107/ml細(xì)胞懸液。
 
2.  取試管3支,標(biāo)明順序,依據(jù)下表依次加入1×107/ml胸腺細(xì)胞懸液、抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度)及Hank’s液,放入37℃水浴30分鐘。
 
3.  取出后每管加入1%伊紅-Y染液1滴,混勻,室溫放置2分鐘。
 
4.  重新混勻后分別在一張載玻片上滴片,加蓋玻片鏡檢。先在低倍鏡下觀察,再用高倍鏡觀察,比較3管中細(xì)胞死活情況。
 
二、實驗結(jié)果
 
死細(xì)胞呈紅色,無光澤且腫脹變大;活細(xì)胞不著色、有光澤且形態(tài)正常。
 
高倍鏡下計數(shù)200個細(xì)胞并計算其中死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。計算公式如下:死細(xì)胞百分?jǐn)?shù)= EQ EQ \F(實驗管死細(xì)胞數(shù)%-對照管死細(xì)胞數(shù)%,100%-對照管死細(xì)胞數(shù)%)


注意事項


1.  胸腺細(xì)胞制備速度要快,且需在冰浴中進(jìn)行操作,以保持細(xì)胞活力;
 
2.  抗Thy-1的單克隆抗體和補體的效價要在預(yù)實驗中確定;
 
3.  細(xì)胞對照管死細(xì)胞數(shù)若超過5%,實驗需重新做;
 
4.  細(xì)胞滴加到載玻片上后長時間放置不檢測也可導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。


常見問題


一、實驗材料
 
1.  解剖器械(眼科剪、眼科鑷)、平皿、80~100目不銹鋼網(wǎng);
 
2.  試管、1 ml吸量管、尖吸管;
 
3.  載玻片、蓋玻片;
 
4.  C57BL/6J小鼠;
 
5.  含5%NBS的冷Hank’s液;
 
6.  抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度,本室制備);
 
7.  補體(豚鼠新鮮血清并經(jīng)小鼠胸腺細(xì)胞吸收,預(yù)先測定效價并稀釋為最佳稀釋度);
 
8.  1%伊紅-Y染液。

二、多重PCR的特點


1.高效性


在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種病原微生物,或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進(jìn)行分型,特別是用一滴血就可檢測多種病原體。


2.系統(tǒng)性


多重PCR很適宜于成組病原體的檢測,如肝炎病毒,腸道致病性細(xì)菌,性病,無芽胞厭氧菌,戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)菌戰(zhàn)劑的同時偵檢。


3.經(jīng)濟(jì)簡便性


多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出,將大大的節(jié)省時間,節(jié)省試劑,節(jié)約經(jīng)費開支,為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。


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安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶,提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑;inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn),包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等,為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù);提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品;提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù),努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。



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