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當前位置：深圳市安培生物科技有限公司>>技術文章>>分子克隆實驗的注意事項和經驗分享
簡介：
分子克隆（基因克隆/DNA重組/載體構建）技術是一種在分子水平上操作的技術，用于將特定的DNA片段從供體生物中分離出來，然后通過體外重組、轉化和轉導等方法，將其插入到適合的克隆載體中，并將重組克隆載體引入到合適的寄主體內進行復制與擴增。可以應用于蛋白表達、病毒包裝、基因治療、細胞治療、mRNA疫苗、RNA干擾、細胞功能等研究。
具體操作流程：
一、聚合酶鏈式反應（PCR）
DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3'-OH末端，并以此為起始點, 沿模板5'→3'方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。
（1）PCR反應基本成分：
①模板DNA
二、線性化載體
三、純化PCR、酶切產物并連接
將反應結束的產物進行純化，純化所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好，目前有多種試劑盒可供選擇；
連接線性化載體和PCR產物，可根據DNA連接酶試劑盒說明書設置，對于較大的片段可以選擇4℃連接過夜。
四、細菌轉化
冰上解凍克隆感受態細胞（DH5α）；取重組產物，加至感受態細胞中，冰上靜置30min，42℃水浴熱激45s，迅速置于冰上2-3min；加入600μL LB液體培養基,37℃搖菌1h。
PCR正常反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，選擇正確條帶的菌液加入對應的培養基，37℃搖起來。
注意事項：
②菌落PCR反應程序變性94℃4-5min即可保證外源DNA釋放出來。
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