一個典型的轉染過程涉及3-4個步驟：貨物包裝，跨膜轉運，細胞內釋放，轉運進入細胞核。貨物的位置很大程度上影響它們是否能夠履行其預期的功能。例如，對于基因編輯，貨物必須定位在細胞核。因為對于長期穩定的基因表達和基因編輯，貨物必須進入細胞核，并整合入基因組中，因此貨物的定位可視化將會非常有用。另外，對于siRNA介導的基因沉默或蛋白瞬時表達，藥物必須被遞送進入細胞質中。熒光共聚焦顯微鏡是最直接的和普遍使用的評估貨物定位的方法。貨物通常用熒光染料染色，細胞核用DAPI染色，從而可視化熒光信號的共定位。可以通過一些方法改善貨物在細胞核的定位，如使用細胞核定位信號和微管相關序列。

在轉染過程中，T細胞可能會經歷不同程度的擾動，進而影響它們的關鍵生理特性，如基因表達。評估細胞擾動有以下幾種方式。鈣離子調節不同的細胞功能，作為第二信使參與多種細胞通路活動。細胞質中的鈣離子水平通常維持在100*10^-9M，遠低于在內質網和線粒體及細胞外環境的鈣離子水平（兩者分別在µM和mM范圍）。細胞內熒光鈣水平的持續增加是細胞壓力的表現，可能會引起應激反應相關的信號通路。在轉染過程中，貨物通過機械穿孔或電流滲透的方式被引入細胞。這些過程在細胞膜上形成了孔道，鈣離子將會順著濃度梯度進入細胞質中。細胞內鈣濃度的水平的增加和高水平的持續時間是膜孔恢復穩態所需時間的指標。一種定量評估鈣壓力的方法是使用熒光指示劑，如Fura-2，Indo-1和Fluo-4，并計算熒光扣除背景熒光之后的變化。另一種觀測細胞內鈣水平的方法是通過使用基因編碼的熒光蛋白，如基因編碼的鈣指示劑（GCaMP）。相比化學指示劑，基因編碼的熒光蛋白不會造成細胞毒性，更適合長期觀測，但挑戰是質粒構造必須被優化以確保蛋白可以穩定表達。

穩健的T細胞激活是細胞快速擴增的先決條件。T細胞早期激活標志物CD69可用于確定是否該生物特性被轉染影響?；罨?，T細胞分泌一系列的效應細胞因子，如IL-2，TNF-α，IFN-γ（可以通過ELISA試驗檢測）。另一個更復雜的方法，多參數細胞因子染色不僅可以用于測定細胞因子的產生，還可以測定特定細胞亞型的功能標記分子。但該實驗方法的缺點是靈敏度低，需要大量的實驗方案優化。

抗原特異性的T細胞可以增強療效和確保安全性。MHC多聚體技術可以用于測量修飾后的CAR受體/T細胞受體（TCR）和遞呈在MHC分子表面的特定腫瘤抗原之間傳導的免疫信號。這種單細胞試驗使用多種MHC-I或MHC-II分子亞基（二聚體到八聚體）分別驗證與表達CAR的CD8+或CD4+TCR之間的免疫作用。常用的四聚體技術是將四個生物素化肽-MHC糖蛋白鏈與鏈酶親和素主鏈連接在一起。

實體瘤對于CAR-T療法仍然是一個巨大的挑戰，一個挑戰是CAR-T細胞的腫瘤浸潤性差。T細胞能夠響應生物分子遷移，而T細胞的遷移是一個非常重要的考量，因為T細胞對化學引誘劑的敏感性和遷移能力影響它們的效力，尤其是對實體瘤的效力。如果T細胞可以在實體瘤里遷移更快更均一，將可能實現更好的臨床效果。Transwell試驗是評價細胞遷移的常用方法，該方法使用一個填充了兩種介質的小室，一種介質是趨化因子如IP-10，另一種是結合了CXCR3受體的化學引誘劑，通過多種膜分開兩種介質。T細胞培養在小室上層，一旦感知到趨化因子的化學梯度，將會遷移到小室下層。培養一段時間后，上層小室被移開，遷移到膜上的細胞數量可以在顯微鏡下通過血球計數確定。膜孔的大小需要謹慎選擇，避免細胞的非特異性轉移。如果使用了熒光標記的T細胞，可以通過熒光顯微鏡觀察隨時間變化的遷移行為。